纪童，蒋齐，王占军，季波

（宁夏农林科学院荒漠化治理研究所，宁夏银川 750002）

干旱地区降水量少、蒸发量大，土壤水分是制约该区域生态系统生产力的主要因素之一［1］。在土壤含水量极低的条件下，地上植物遭遇水分缺失，会从生长发育、形态结构、膜系统、抗氧化酶系统、渗透调节系统等多个方面作出响应［2］，如脯氨酸（proline，Pro）在植物受到逆境胁迫时会在植物体内积累，使植株对逆境的忍耐力和抵抗力增强［3］，因此，常用其增幅来评价植物抗旱性的强弱，抗旱性强的植物其增加相对较快并且含量高［4-5］，说明不同胁迫下的生理指标变化不同。因此，干旱胁迫下植物生理指标的变化被广泛用于植物抗旱能力的评价，但单一利用生理指标变化或农艺性状变化进行评价往往存在片面性，且无法界定试验中各植物自身适宜的土壤水分范围，存在一定限制。

在干旱条件下，植物不仅表现为生理指标的变化，还因缺失水分而出现植物叶片褪绿、生长减缓等形态特征的变化，逐步进入衰老死亡的进程，但不同基因型的牧草抗旱能力不同，其衰老点与衰老速率不同，抗旱性强的牧草在干旱胁迫过程中衰老延迟而且仍保持持续生长能力［6］。因此结合植物生长绿叶数及株高形态指标的变化，干旱条件下植物正常生长时土壤含水量响应阈值，植物生理指标综合评价，对准确评判植物抗旱性意义重大。

宁夏地处我国西北内陆农牧交错地带干旱、半干旱气候区，尤其以盐池为代表的中部干旱风沙区［7］，土壤水分是制约该区域农业生产和草地植被建植的关键因素，筛选抗旱性强的牧草对于该区域农牧业生产及草地植被生态恢复具有非常重要的意义。本研究采用均方根偏差法（the root mean square deviation，RMSD）计算绿叶、株高收益与土壤水分收益的权衡值，将权衡值与土壤含水量作为分位数模型变量［8］，确定维持植物正常生长的土壤含水量的响应阈值，同时研究干旱胁迫下生理指标综合评价值，进行抗旱性评价。筛选出适宜的抗旱性牧草资源，阐明不同牧草的抗旱特征，从而为干旱区优质抗旱牧草的筛选及因地制宜的实践生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取7 种优质的多年生禾本科牧草：蒙古冰草-宁夏（Agropyron mongolicum-Ningxia）、蒙古冰草-内蒙古（A. mongolicum-Inner Mongolia）、沙生冰草（Agropyron desertorum）、扁穗冰草（Agropyron cristatum）、细茎冰草（Agropyron trach）、格兰马草（Bouteloua gracilis）、老芒麦（Elymus sibiricus）进行抗旱性研究，具体牧草信息见表1。

表1 供试植物Table 1 Test plants

1.2 试验设计

采用盆栽控水法，于2019 年4 月在盐池县四墩子实验基地，用统一规格（20 cm×20 cm×30 cm）的塑料花盆装入一致的大田土壤，将7 种牧草种子种于花盆中（播种量为每盆30 粒种子），于温室内进行培育，至苗期稳定后间苗，保证花盆中苗数相同，试验设干旱处理组，每组设相应对照，每个品种7 个重复，对照组持续浇灌水。干旱组处理每个品种10 个重复，共计70 个花盆。7 月10 日开始胁迫试验，试验开始前连续3 d 浇透水，保证土壤吸足水分，然后开始断水处理，测定持续干旱组和对照组各植物生理指标、土壤含水量、植物绿叶数及株高。

花盆土壤取自盐池县四墩子实验基地，供试土壤理化性质见表2。

表2 供试田间土壤理化性质Table 2 The physical and chemical properties of the tested field soil

1.3 测定指标与方法

1.3.1生理指标测定与计算 取样时间为早晨8：00-9：00。在不同干旱胁迫取样时间内选取中上部长势一致的健康叶片、迅速放入冰盒，带回室内放入-40 ℃超低温冰柜中保存，待用。所有指标均采用实验室方法进行测定。叶绿素（chlorophyll，Chl）含量采用酒精浸提法［9］测定，脯氨酸含量采用磺基水杨酸法［9］测定，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法［10］测定，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮蓝四唑法［11］测定，过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈创木酚比色法［11］测定，过氧化氢酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法［11］测定，可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮法［11］测定。

1.3.2相对值的计算 计算公式［12］如下：抗旱胁迫指数(drought resistance index，DRI) =

1.3.3抗旱性评价 在植物抗旱性研究中，模糊数学隶属函数法［12］被广泛应用，本研究也采用此方法对不同牧草种质资源的抗旱性进行评价。

式中：μxj表示第j个指标的隶属函数值；xj表示第j个指标值；xmin表示第j个指标最小值；xmax表示第j个指标最大值，xˉj表示第j个指标平均值；xij表示式中为i材料j性状的隶属函数值；vj表示第j个指标标准差系数；wj表示第j个指标的权重；D表示各材料的抗旱生理评价值。

1.3.4土壤含水量测定与计算 花盆土壤含水量采用称重法［13］测定。试验开始前对每个空花盆进行编号并称重（G2，kg）。在试验结束后，将每个带土花盆称重后倒出所有土，然后将不同土层的湿土混匀，并取6 个土样，放入铝盒中带回实验室在105 ℃烘箱内烘干，求取含水量以计算各花盆中的干土重（G3，kg）。然后，利用试验期间每日花盆重（G1，kg），计算每日各花盆的土壤质量含水量（T1，%）。

田间土壤含水量采用Hydra Probe 土壤多参数传感器（Stevens water 公司，美国）测定。每月定期进行土壤体积含水量的监测，每月测定3 次，每个牧草3 次重复。

1.3.5绿叶数和株高测定 试验胁迫开始前将花盆牧草进行定株，每日记录定株苗上的绿叶数与株高。

1.3.6土壤含水量阈值确定 采用均方根偏差法计算

式中：Wi和Gi分别是土壤水分和叶片数。Wmin和Wmax分别是土壤水分在所有样本中的最小值和最大值，Gmin与Gmax分别是绿叶数在所有样本中的最小值和最大值。

如图1 所示，RMSD 通过某一绿叶数和土壤水分坐标点到1∶1 线的距离来表征二者之间的权衡关系，在1∶1 线上（如点C），二者权衡为0；距离1∶1 线越远（如点A 与B），二者权衡度越大。此外，数据点相对于较1∶1 线的位置也可说明哪种指标的收益更多一些，点B 表示土壤水分收益，即土壤水分足以维持当前植物绿叶数（未受胁迫）；而点A 表示绿叶数收益，意味着土壤水分不足以维持当前植物绿叶数（受胁迫）。

图1 均方根偏差法Fig.1 Root mean square deviation method

1.3.7分位数回归 分位数回归［14］提出的原因，就是不希望仅仅是研究因变量（y）的期望，而是希望能探索y的完整分布状况，或者说可能在某些情况下本研究更希望了解y的某个分位数。试验中因权衡值的引入，将数据分为了两部分，即权衡值≥0 时认为牧草为正常生长状态，权衡值<0 时认为植物处于胁迫状态，为探索各牧草正常生长（权衡值≥0）的土壤含水量阈值的大小，则需要引入分位数模型，计算权衡值≥0 的数据分位点，得出分位数回归模型，利用回归线与X 轴交点确定土壤含水量阈值。分位数回归模型基本情况见表3。

表3 各牧草权衡值≥0 的分位点Table 3 The quantile with the weighted value of each forage ≥0

为检验分位数模型是否符合实际情况，试验前将数据分为建模组与检验组，样本数详见表3，建模后将检验组数据带入分位数回归模型中，利用实测值与预测值的拟合系数（R2）与均方根误差（root mean square error，RMSE）判断模型优劣，得到科学合理的分位数模型。

1.4 数据分析与处理

使用软件Excel 和SPSS 21.0 进行数据的方差分析，利用R 语言quantreg 包建立分位数回归模型，并用R 语言ggplot 2 包进行作图。

2 结果与分析

2.1 绿叶数和株高对干旱胁迫的响应

2.1.1绿叶数对干旱胁迫的响应 由图2 可知，7 种牧草对照组绿叶数随处理时间的延长呈先上升后平稳的趋势，各牧草处理组大体呈先上升后下降的趋势，牧草D、E、F 与G 在试验前期（7 月10 日-7 月13 日）出现处理组绿叶数高于对照的现象，说明适度的干旱胁迫有助于牧草D、E、F 与G 的生长，而随干旱胁迫的增强牧草D、E、F 与G 均表现为对照组绿叶数显著高于处理组（P<0.05），说明长时间的干旱胁迫影响了牧草正常的生活史，不利于牧草生长。

图2 禾本科牧草绿叶数Fig.2 The green leaves number of Gramineous forage

2.1.2株高对干旱胁迫的响应 由图3 可知，7 种牧草对照组株高随处理时间的延长呈先上升后平稳的趋势，各牧草处理组各时期株高大体呈先上升后下降的趋势，各牧草试验中后期（7 月21 日-7 月29 日）均表现为对照组株高显著高于处理组（P<0.05），说明干旱胁迫影响了牧草的生长发育，但抗旱能力强的牧草仍能维持正常的生活史。

图3 禾本科牧草株高Fig.3 The plant height of Gramineous forage height

2.2 土壤含水量响应阈值

2.2.1土壤含水量阈值确定 利用各抗旱植物的绿叶数与土壤含水量进行权衡分析，采用分位数回归拟合均方根偏差（RMSD）沿土壤含水量梯度上的权衡过程和响应阈值（图4），结果表明，各抗旱植物分位数回归模型与0 权衡的交点即为土壤含水量的关键转折点，7 种禾本科植物中仅E 与F 分位数回归模型的截距与斜率通过了显著性检验（P<0.05），其余植物分位数模型均未通过检验。E 与F 的干旱胁迫土壤响应阈值分别为9.1%与9.7%，即当土壤含水量低于9.7%时，牧草F 权衡值为负值且沿含水量的降低权衡增大，土壤含水量的相对收益减小。维持植物的绿叶数是以消耗土壤水分为代价，当土壤含水量等于9.7%时，权衡值为0，说明当前水分足以维持植物正常生长（图4）。根据田间最低土壤含水量（8%）与土壤干旱程度分级标准（土壤含水量8%左右为中旱土壤），牧草E 与F 土壤含水量阈值符合中旱土壤要求，说明牧草E 与F 在该地区中旱的土壤中耐受干旱胁迫，可以作为抗旱优质牧草。

图4 绿叶数-土壤含水率权衡沿土壤含水率梯度的分布Fig.4 The distribution of the number of green leaves-soil water content trade-off along the soil water content gradient

从图5 可以看出，各抗旱植物分位数回归模型与0 权衡的交点即为土壤含水量的关键转折点，7 种禾本科植物中仅A、B、E、F 分位数回归模型的截距与斜率通过了显著性检验（P<0.05），其余牧草分位数模型均未通过检验。其中A、B、E、F 株高-土壤含水量阈值分别为13.0%、13.8%、4.9%、5.6%，根据田间最低土壤含水量（8%）与土壤干旱程度分级标准（土壤含水率5%左右为重旱土壤），牧草E 与F 土壤含水量阈值符合重旱土壤要求，说明牧草E 与F 能够在该地区重旱的土壤中维持自身株高，耐受干旱胁迫，可以作为抗旱优质牧草。而牧草A 与B 土壤含水量阈值仅在轻度干旱（土壤含水率：12%~15%）范围内，说明牧草A 与B 可以在该地区轻度干旱的环境下进行生长，可以作为轻度干旱区域的引种牧草。

图5 株高-土壤含水率权衡沿土壤含水率梯度的分布Fig.5 The distribution of plant height-soil water content trade-off along the soil water content gradient

2.2.2模型检验 通过显著性检验的共有6 个分位数模型，即牧草A 株高-土壤含水量、牧草B 株高-土壤含水量、牧草E 绿叶数-土壤含水量、牧草E 株高-土壤含水量、牧草F 绿叶数-土壤含水量与牧草F 株高-土壤含水量权衡分位数模型，利用检验组数据对模型进行验证。由图6 可知，牧草B 株高-土壤含水量权衡分位数模型拟合系数较差（0.1438），模型未通过检验（图6b）；牧草F 的2 个分位数模型检验组拟合系数均达到0.9 以上，均方根误差（RMSE）较小，分别为0.12 与0.09（图6d，f），牧草E 株高-土壤含水量权衡分位数模型拟合系数为0.525，RMSE 为0.10（图6c），绿叶数-土壤含水量权衡分位数模型的拟合系数为0.80，RMSE 为0.38（图6e），模型精度较好；说明分位数模型可以确定维持牧草E 与F 生长（绿叶数、株高）的土壤含水量响应阈值。

图6 模型检验Fig.6 Model checking

2.3 生理指标对干旱胁迫的响应

由图7 可知干旱胁迫下，7 份供试牧草的过氧化物酶与超氧化物歧化酶活性均呈逐渐上升的趋势，且干旱胁迫后各牧草植物叶片过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性与对照组相比均达显著差异水平（P<0.05）。

图7 干旱胁迫对各牧草生理指标的影响Fig.7 Effects of drought stress on physiological indexes of forage grasses

7 份供试牧草中牧草E、G 在各时期胁迫处理下与对照组过氧化氢活性均无显著差异（P>0.05），牧草B、D、E 胁迫后期出现过氧化氢酶活性下降的趋势，牧草B 胁迫后期过氧化氢酶活性显著低于对照组（P<0.05）。

7 份供试牧草中叶绿素与可溶性糖含量大体呈先上升后下降的趋势，丙二醛含量呈先下降后上升的趋势，且干旱胁迫后各牧草植物叶片叶绿素、丙二醛、可溶性糖含量与对照组相比均达显著差异水平（P<0.05）。

7 份供试牧草中脯氨酸含量大体呈逐渐上升的趋势，且干旱胁迫后各牧草植物叶片脯氨酸含量与对照组相比均达显著差异水平（P<0.05）。

2.4 抗旱性评价

选取供试7 份牧草的7 项生理指标POD、SOD、CAT、MDA、SS、Pro、Chl 进行综合分析，计算7 份牧草各指标下的DRI 隶属值与权重，并以综合评价值（D 值）鉴定供试牧草抗旱性。结果表明7 种多年生牧草抗旱性大小为：A>F>E>B>C>D>G，抗旱性最强的为牧草A，抗旱性最弱的为牧草G（表4）。结合各牧草土壤含水量阈值排序（细茎冰草>格兰马草）与牧草生理指标抗旱评价（蒙古冰草-宁夏>格兰马草>细茎冰草>蒙古冰草-内蒙古>沙生冰草>扁穗冰草>老芒麦）得出细茎冰草与格兰马草不仅在重旱地区能够维持自身农艺性状，自身抗旱生理机制也十分突出，因此试验筛选出细茎冰草与格兰马草作为引选牧草。

表4 抗旱性评价D 值Table 4 Physiological drought resistance evaluation D value

3 讨论

3.1 绿叶数和株高对干旱胁迫的响应

作物在水分胁迫下，体内细胞在结构、生理及生物化学上发生一系列适应性改变后，最终要在植株形态上有所表现，绿叶数与株高变化是牧草植物对于干旱胁迫最为明显的响应［15］。本研究中禾本科牧草随干旱胁迫加剧，其绿叶数与株高均呈下降的趋势，说明干旱胁迫程度越高，牧草的农艺性状受到的负面影响就越大。尹飞［16］发现水分胁迫减少了单株玉米（Zea mays）叶面积，降低了株高和茎粗；吴佳宝［17］研究表明，干旱胁迫导致不同花生（Arachis hypogaea）品种叶片的萎蔫程度差异较大，并且抑制了所有花生品种的株高、叶片长，本研究结果与其一致。

试验中还发现蒙古冰草-宁夏在胁迫中期（7 月18 日、7 月21 日）也出现绿叶数增多的情况，可能是轻度干旱胁迫下抗旱能力强的植株通过自身调节营养分配适应不良环境，促进了植株的生长发育。欧阳建勇等［18］发现适度的干旱胁迫有助于促进苦荞（Fagopyrum tataricum）叶片的生长发育；裴保华等［19］研究表明，随干旱胁迫时间的不断延长，抗旱性强的柠条（Caragana korshinskii）的叶片数增多，要显著高于抗旱性稍弱的紫穗槐（Amorpha fruticosa）和沙棘（Hippophae rhamnoides），本研究结果与其一致。

3.2 土壤水分阈值确定

土壤水分和绿叶数与株高在土壤含水量梯度上存在协同和权衡关系。牧草抗旱性状表现不仅与水分利用密切相关，还与自身生理抗旱机制紧密相关［20］，而这些功能又与土壤水分存在明显的相关关系。本研究发现，牧草细茎冰草、格兰马草土壤含水量9.1%与9.7%是维持植物绿叶数的土壤含水量的转折点，4.9%与5.6%是维持株高正常生长土壤含水量的转折点，在转折点以上水分区间，绿叶数、株高与土壤水分的关系基本在零权衡以上，即株高与绿叶数、土壤水分条件是相适宜的，当前土壤水分条件能够承载牧草生长发育。一般认为，土壤含水率5%以下时即为重旱地区，8%左右为中旱地区，降水稀少，土壤水分严重不足［21-22］，本研究表明，牧草细茎冰草与格兰马草能够适应典型干旱区域，可以作为干旱区域的牧草引进品种，通过权衡分析界定维持牧草植物农艺性状的土壤水分的区域，可为植被恢复与因地制宜建植牧草提供科学方法和理论依据。

3.3 抗旱性评价

植物抗旱能力强弱不仅表现在植物农艺性状上，植物生理机制变化也是评价植物抗旱性的具体体现［23］。SOD 是植物过氧化胁迫防御体系中的第一道防线，主要参与清除O2-，产生H2O2，提高植物组织的抗氧化能力［24］，CAT 和POD 协同作用清除细胞内过多的过氧化氢，使其保持在一个较低的水平，从而保护细胞膜的结构。本研究通过测定7 种牧草抗氧化酶活性，结果表明不同牧草品种抗氧化防御能力与机制不同，部分牧草植物存在POD 活性上升，SOD 与CAT 活性下降的现象，可能是干旱胁迫下3 种酶的协同作用，在CAT 活性下降的情况下，保持相对较高的POD 活性，有利于H2O2清除，减少过氧化伤害。Fu 等［25］发现草地早熟禾（Poa pratensis）在长期的轻度干旱胁迫下，引起了SOD，POD 和CAT 活性下降。Dacosta 等［26］也发现干旱胁迫会导致翦股颖属（Agrostis matsumurae）草坪草SOD 和CAT 活性下降，本研究结果与其一致。

丙二醛的变化能直接反映膜系统受损程度，抗性越强的种质，其MDA 的上升幅度越小［27］，因此评价牧草抗旱性时将MDA 作为负向指标，本试验干旱胁迫下各牧草MDA 含量较对照组均有不同程度的上升，牧草格兰马草的丙二醛含量上升幅度最小。

Pro 和SS 的积累只是植株在严重缺水时的一种损伤表现，植物通过增加可溶性糖与脯氨酸含量来维持细胞内外膨压的稳定与对逆境的忍耐力和抵抗力，达到保护细胞内的酶类的作用［28］，抗旱性强的植物增加相对较快并且含量较高，因此可以将植物体内可溶性糖的含量作为抗旱机制研究的指标。因此试验中将Pro 与SS 作为正向评价指标。

植物的抗旱性是受多种因素影响的复杂数量性状，尤其对植物苗期来说，其本身也是一个受多种因素影响的复杂的生理生化过程。本研究采用POD、SOD、CAT、MDA、SS、Pro、Chl 共7 项指标，结合隶属函数法对7 种多年生禾本科牧草材料苗期的抗旱性进行综合评价发现，牧草抗旱性由大到小分别为蒙古冰草-宁夏>格兰马草>细茎冰草>蒙古冰草-内蒙古>沙生冰草>扁穗冰草>老芒麦。

土壤水分是制约草地植被建植的关键因素，筛选抗旱性强的牧草对于区域草地植被生态恢复具有非常重要的意义，实际草地建植过程中因各地土壤含水量的差异，筛选适宜本地区土壤含水量的牧草十分困难，试验利用牧草生理指标抗旱评价得出牧草抗旱性排序结果为：蒙古冰草-宁夏>格兰马草>细茎冰草>蒙古冰草-内蒙古>沙生冰草>扁穗冰草>老芒麦，在了解了植物抗旱性强弱后，研究农艺性状-土壤含水量阈值，得出细茎冰草与格兰马草在中度干旱地区（土壤含水量为8%左右）能够维持自身农艺性状，综合牧草农艺性状权衡分析土壤含水量阈值与牧草自身生理抗旱机制，为植被恢复与因地制宜建植牧草提供科学方法和理论依据。

4 结论

1）干旱胁迫程度越高，牧草的农艺性状受到的负面影响就越大；不同品种的基因型与抗旱机制不同，其耐受程度和范围也有差异，适度的干旱可以促进抗旱能力强的牧草的生长发育并提高牧草质量；

2）细茎冰草和格兰马草的绿叶数-土壤含水量阈值分别为：9.1%、9.7%；细茎冰草、格兰马草、蒙古冰草-宁夏和蒙古冰草-内蒙古的株高-土壤含水量阈值分别为4.9%、5.6%、13.0%、13.8%；

3）7 种多年生禾本科牧草抗旱性强弱表现为：蒙古冰草-宁夏>格兰马草>细茎冰草>蒙古冰草-内蒙古>沙生冰草>扁穗冰草>老芒麦；

4）细茎冰草与格兰马草相较于其余禾本科植物抗旱能力较强，且细茎冰草与格兰马草土壤含水量阈值符合典型干旱区域土壤含水量，能够适应中度干旱区域（8%左右），可以作为干旱区域的牧草引进品种；

5）传统研究植物抗旱性多为研究植物生理变化评价植物抗旱性，且无法界定试验中各植物自身适宜的土壤水分范围，存在一定限制，相较于传统抗旱性研究，本试验引入了利用农艺性状权衡分析土壤含水量阈值的概念，得出维持牧草农艺性状的土壤水分阈值，使因地制宜成为可能，且综合牧草农艺性状权衡分析土壤含水量阈值与牧草自身生理抗旱机制，可为植被恢复与因地制宜建植牧草提供科学方法和理论依据。