李君风，赵杰，唐小月，代童童，董东，宗成，邵涛

（南京农业大学草业学院饲草调制加工与贮藏研究所，江苏南京 210095）

农作物秸秆是自然界中最丰富、最廉价的反刍动物饲料资源，开发利用适合于南方气候条件下庞大的“非常规饲料资源”，并将其调制成优质青贮饲料是促进当地节粮型畜牧业发展的有效措施。农作物秸秆粗纤维含量高，水溶性碳水化合物含量低，难以调制出优质青贮饲料。目前许多研究通过添加外源纤维素酶，达到改善青贮发酵品质的目的，但由于酶制剂成本高、性能不稳定及pH 适应范围较狭窄等因素，限制了其在青贮中的广泛应用［1-2］。因此获得能高效降解农作物秸秆粗纤维的微生物资源是农作物秸秆饲料化利用的关键。纤维素降解菌具有安全、低成本和适应性广等优点，可降解植物中的结构性碳水化合物，并将其转化为单糖进而被乳酸菌利用。

近年来，随着人们对微生物群体功能的认识逐步加深，开始关注自然条件下微生物之间互作协同作用，并将这一理念应用于纤维素降解的研究与实际应用中［3］。纤维素降解复合菌系是由多种不同的细菌群落组成，它们能够分泌降解能力强、种类多的纤维素降解酶［4］。复合菌系产生的酶系种类较单菌株更为多样，进而能避免单菌株降解粗纤维时的底物抑制和反馈抑制因素［5］。反刍动物瘤胃是自然界中完善的天然消化发酵体系和微生态系统，被喻为丰富的纤维素降解菌资源库［6］。从反刍动物瘤胃中筛选出高效而稳定的兼性厌氧纤维素降解复合菌系，将其作为青贮添加剂来改善发酵品质和消化率，更具有安全性、适应性和实际应用价值。添加纤维素降解复合菌系，可有效地降低纤维素的结晶度、增加孔隙和表面积，可促进酶与底物相互接触并反应，提高酶解糖化率［7］，释放水溶性碳水化合物供乳酸菌利用，快速产生乳酸降低pH，抑制有害微生物的活性，提高青贮饲料发酵品质、适口性和消化率。Ren 等［8］发现在甜高粱（Sorghum bicolor）青贮中添加不同水平的瘤胃液能有效地改善甜高粱发酵品质，增加结构性碳水化合物的降解，提高乳杆菌属（Lactobacillus）的丰富度。Zhao 等［9］将2 株具有较高纤维素酶活性的瘤胃源纤维素降解菌分别添加到象草（Pennisetum purpureum）、全株玉米（Zea mays）、甜高粱中青贮120 d 后，均降低了青贮饲料的粗纤维含量，释放出水溶性碳水化合物，改善了发酵品质。此外，瘤胃微生物能有效地分泌降解水稻（Oryza sativa）秸秆粗纤维所需的辅助酶，易获得纤维素侧链，促进了复合菌系对植物多糖的降解能力［10］。因此挖掘与利用青贮用瘤胃高效纤维素降解微生物资源，丰富特色功能性微生物种质资源库，对优质青贮饲料生产具有重要的实际意义。

本试验从黑白花奶牛瘤胃中筛选高效兼性厌氧纤维素降解复合菌系，探讨其对水稻秸秆青贮过程中结构性碳水化合物降解及发酵品质的影响，为纤维素降解复合菌系在农作物秸秆青贮饲料生产中的应用及新型青贮添加剂的研制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及培养基

试验材料为成熟期的水稻（Yongyou No. 9），来自宁波市农机畜牧中心试验地（29.87° N，121.53° E，海拔6 m，浙江），于2019 年7 月28 日将成熟期的水稻进行刈割，并去除稻穗，切短（1~2 cm 左右）后，充分混合。随机取6 份鲜样，进行化学及微生物成分分析。瘤胃内容物收集于宁波市奶牛场黑白花奶牛［年龄在3 周岁，体重为（750±30）kg］。蛋白胨纤维素（peptone cellulose solution，PCS）培养基（g·L-1）：1 g 酵母膏，5 g 蛋白胨，2 g CaCO3，5 g NaCl，以1%水稻秸秆（碱性处理后）和0.3 g Whatman NO.1 滤纸为碳源。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、布什乳杆菌（Lactobacillus buchneri）为本实验室的乳酸菌。将其分别活化两次后接入deMan-Rogosa-Sharpe 液体培养基，于30 ℃培养24 h 后，用生理盐水调为1.0×108cfu·mL-1。

1.2 试验方法

1.2.1黑白花奶牛瘤胃兼性厌氧纤维素降解复合菌系的筛选及鉴定 采集黑白花奶牛瘤胃内容物，将匀浆处理后的1 mL 滤液接种至装有50 mL 蛋白胨纤维素液体培养基（PCS）的血清瓶中，39 ℃下厌氧振荡培养6 d 后，按2%的接种量，转接至新的培养基中，重复6~9 次获得稳定的菌系，刚果红染色初筛，耐酸诱导复筛，观察不同时间点复合菌系对滤纸的崩解效果（图1），筛选出滤纸崩解速度快、降解程度明显的复合菌系作为复筛复合菌系［11］。经酶活力测定，获得高效兼性厌氧纤维素降解复合菌系M6；收集培养液提取菌体DNA，对样品DNA 送样进行高通量测序分析（上海美吉生物医药科技有限责任公司），利用Illumina Miseq PE300 平台测序［12］。

图1 不同培养时间点复合菌系对滤纸的崩解效果Fig. 1 Disintegration of filter paper by microbial consortium during culture

将复合菌系M6 接种于以水稻秸秆为碳源的PCS 培养基中，于150 r·min-1、37 ℃条件下，培养6 d，每隔24 h取 样 离 心，上 清 液 在10000 r·min-1下，离 心10 min，依 据Miller［13］和Luo 等［14］的 方 法，分 别 以 微 晶 纤 维 素（microcrystalline cellulose，MCC）、羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose，CMC）、水杨苷和木聚糖为底物，测定外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的活力。每分钟产生1 μmol 还原糖（葡萄糖或木糖）的酶量为1 个酶活力单位（U）［15］。每个酶活力测定设5 个重复。

1.2.2青贮饲料的调制 称取120 g 切短的水稻秸秆装填至聚乙烯袋中（45 cm×35 cm），用真空包装机（DZD-400，南京奥米泰科技有限公司）迅速抽真空及热塑封口。共计72 个青贮袋，其中54 个青贮袋用于γ 辐射灭菌，辐照源为60Coγ，辐射剂量为32 kGy，辐射时间为4 h［16］。试验设4 个处理组：1）CK：新鲜水稻秸秆直接青贮；2）IRR：灭菌后水稻秸秆青贮；3）CLAB：灭菌水稻秸秆接种复合乳酸菌（包括植物乳杆菌>5×108cfu·g-1FW，戊糖片球菌>2×108cfu·g-1FW 和布什乳杆菌>2×108cfu·g-1FW）；4）M6：灭菌水稻秸秆接种纤维素降解复合菌系M6，复合菌系M6 在Luria-Bertani（LB）培养基中培养48 h（OD600≈1.2），接种浓度为1×106cfu·g-1FW。分别于青贮后的第3、6、15、45、60 和90 天开袋，取样分析各项指标。每个处理组各时间点分别设5 个重复。

1.2.3水稻秸秆青贮前后生物化学分析 将新鲜水稻秸秆和青贮饲料按照四分法取60 g，65 ℃烘干48 h 至恒重，测定干物质（dry matter，DM）含量，烘干样品粉碎过1 mm 筛，用于测定粗纤维组分。采用范氏纤维分析法［17］，应用滤袋技术测定鲜样及青贮饲料的中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）、酸性洗涤木质素（acid detergent lignin，ADL）含量，纤维素含量为ADF 与ADL 之间的差值，半纤维素含量为NDF 与ADF 之间的差值。取20 g 青贮饲料样品置于250 mL 锥形瓶，与120 mL 蒸馏水混合，在4 ℃冰箱静置24 h 后，过滤提取浸提液，测定pH 值和有机酸［乳酸（lactic acid,LA）、乙酸（acetic acid,AA）、丙酸（propanoic acid,pa）、丁酸（butyric acid,BA）］含量。有机酸含量测定步骤参考宗成等［18］的方法，用安捷伦1260 型高效液相色谱仪测定（流动相：2.5 mmol·L-1H2SO4；流速：0.5 mL·min-1；温度：55 ℃）。采用弗氏评分法［19］以青贮饲料中乳酸、乙酸、丁酸占总酸的比例为基础来评价青贮饲料的发酵品质。得分在81~100 分为优；61~80 分为良；41~60 分为尚可；21~40 分为中；0~20 分为劣。

取10 g 新鲜水稻秸秆或青贮饲料于锥形瓶中，加入90 mL 蒸馏水混合，于37 ℃、150 r·min-1振荡条件下培养1 h 后，分别利用deMan-Rogosa-Sharpe 琼脂培养基（厌氧条件下在37 ℃恒温培养箱中培养48 h）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（有氧条件下在28 ℃恒温培养箱中培养48 h），对鲜样和青贮饲料中的乳酸菌、酵母菌、霉菌进行平板计数［10］。剩余的青贮饲料进行真空冷冻干燥处理，称取0.5 g 冻干样品至10 mL 离心管中，经Millipore 水90 ℃浸提、活性炭和少量树脂预处理离心，采用高效液相色谱法（安捷伦HPLC 1260，色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z，流动相：0.3%的乙腈氨水溶液，流速：0.5 mL·min-1，温度：35 °C）测定青贮饲料中单糖和双糖（葡萄糖、纤维二糖、果糖、木糖、蔗糖）含量，采用硫酸-蒽酮比色法测定总的水溶性碳水化合物（watersoluble carbohydrate，WSC）含量［20-21］。

1.3 数据处理

采用SAS 软件GLM 程序对试验数据进行方差分析（ANOVA），其模型为：Yijk= μ+αi+βj+αβij+ eijk，其中μ为平均值，αi为不同处理效应，βj为不同青贮时间效应，αβij为青贮时间与处理之间的交互作用，eijk为误差。采用Tukey’s 多重比较法对处理组平均值进行比较，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解复合菌系M6 的细菌组成及各酶活力

本试验从黑白花奶牛瘤胃中筛出一组兼性厌氧纤维素降解复合菌系M6。如图2 所示，复合菌系M6 属水平上主要微生物组成为埃希氏菌属（Escherichia）、乳球菌属（Lactococcus）和肠球菌属（Enterococcus），相对丰富度分别为48.59%、31.49%和19.83%。纤维素降解复合菌系M6 在以水稻秸秆为碳源的培养过程中，其各种酶活力如表1 所示，随着培养时间的延长，各种酶活力逐渐上升。培养第6 天，外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活力均达到最大值，分别为2.71、3.44、1.59 和3.91 U·mL-1。

表1 纤维素降解复合菌系M6 的各种酶活力Table 1 Various enzyme activities of cellulolytic microbial consortium M6（U·mL-1）

图2 兼性厌氧纤维素降解复合菌系M6 的细菌组成Fig. 2 Composition of facultative anaerobic cellulolytic microbial consortium M6

2.2 青贮前水稻秸秆的微生物成分和化学特性

新鲜和灭菌后水稻秸秆化学和微生物成分如表2 所示，灭菌后水稻秸秆各化学成分与灭菌前水稻秸秆几乎没有差异。灭菌后水稻秸秆没有检测到微生物，表明γ 射线能较好地消除水稻秸秆表面附着的微生物。

表2 灭菌前后水稻秸秆化学和微生物成分Table 2 Chemical composition and microbial population of fresh and irradiated rice straw prior to ensiling

2.3 水稻秸秆青贮发酵品质

表3显示了水稻秸秆青贮过程中pH 值、有机酸含量和乳酸/乙酸（LA/AA）值的动态变化，不同处理组、青贮天数以及它们的交互作用显著影响了乳酸（LA）含量、pH 和LA/AA 值（P<0.001）。各处理组pH 值（除IRR 组外）虽有波动，但整体呈下降趋势。青贮3 d 后，M6 处理组pH 始终低于其他各组，且在青贮第60 天达到最低值4.62（P<0.05）。LA 含量在M6 处理组呈上升趋势，而CK 和CLAB 呈先上升后下降趋势。青贮45 d 后，M6 处理组LA 含量始终显著高于其他各组（P<0.05），且在青贮90 d 达到最高值（23.90 g·kg-1DM）。随着青贮的进行，乙酸（AA）含量在CK 和M6 处理组中呈上升趋势，CK 和M6 处理组乙酸含量均高于其他两组。整个青贮期间，各处理组中丙酸和丁酸含量均低于对照组（CK）。对青贮第90 天的水稻秸秆青贮饲料有机酸含量进行费氏评分，结果如表4 所示。CK 组的得分为32，青贮发酵品质中等；CLAB 与M6 组得分分别为69 和79，品质为良。

表3 水稻秸秆青贮过程中pH 值、有机酸含量和乳酸/乙酸的动态变化Table 3 Dynamic changes of pH value，organic acid content and lactic acid/acetic acid of rice straw silage

表4 青贮90 d 水稻秸秆发酵品质费氏评分Table 4 The Flieg score of fermentation quality of 90 days rice straw silage

2.4 水稻秸秆青贮过程中结构性碳水化合物降解

从表5 可知，处理和青贮时间均显著影响水稻秸秆青贮饲料的NDF、ADF 和纤维素的含量（P<0.001）。整个青贮过程中，各结构性碳水化合物组分（除酸性洗涤木质素）整体呈下降趋势。青贮15 d 后，NDF、ADF、纤维素含量在M6 组均显著低于其他各组（P<0.05），半纤维素含量在M6 组也均低于其他各组，且在第90 天显示最低的NDF（590.15 g·kg-1DM）、ADF（372.63 g·kg-1DM）、半纤维素（217.52 g·kg-1DM）和纤维素（318.61 g·kg-1DM）含量。青贮期间各组酸性洗涤木质素（ADL）含量差异不显著（P>0.05）。

表5 水稻秸秆青贮过程中结构性碳水化合物组分变化Table 5 Changes in structural carbohydrates components of rice straw silage（g·kg-1 DM）

2.5 水稻秸秆青贮过程中水溶性碳水化合物组分变化

水稻秸秆青贮过程中水溶性碳水化合物（WSC）、蔗糖、纤维二糖、果糖、木糖和葡萄糖的动态变化如图3 所示，不同处理、青贮时间和它们的交互作用均显著影响水稻秸秆青贮过程中水溶性碳水化合物组分的含量（P<0.001）。青贮前15 d，除IRR 组，其他各处理组中WSC、蔗糖、果糖、木糖、纤维二糖和葡萄糖含量迅速下降，青贮15 d 后，WSC、蔗糖、果糖、木糖、纤维二糖和葡萄糖含量在复合菌系M6 组和灭菌组（IRR）保持相对较高水平，而对照组（CK）和乳酸菌处理组（CLAB），WSC、蔗糖、果糖、木糖、纤维二糖和葡萄糖含量持续下降，直到青贮结束时达到最低水平。青贮60 d 后，IRR 和M6 组各水溶性碳水化合物组分含量保持较高水平，其次为CLAB 组。

图3 水稻秸秆青贮过程中水溶性碳水化合物，蔗糖，果糖，纤维二糖，木糖和葡萄糖的变化Fig. 3 Dynamic changes of residual water-soluble carbohydrates，sucrose，fructose，cellobiose，xylose，and glucose of rice straw silage

3 讨论

本试验经限制性诱导培养、刚果红染色初筛，耐酸诱导筛选和滤纸降解复筛，从黑白花奶牛瘤胃中筛出一组兼性厌氧纤维素降解复合菌系M6。通过传统微生物培养方法结合高通量测序对复合菌系M6 进行微生物多样性分析，复合菌系M6 属水平上主要微生物组成为埃希氏菌属（Escherichia）、乳球菌属（Lactococcus）和肠球菌属（Enterococcus）。这些微生物在纤维素降解中比较常见，如Pang 等［22］从牛瘤胃中分离到的纤维素降解大肠杆菌ZH-4（Escherichia coliZH-4）具有细胞外纤维素酶活性，可降解培养基中的纤维素。Luo 等［14］对成年和幼年期长足大竹象虫（Cyrtotrachelus buqueti）肠道中具有降解纤维素能力的微生物进行鉴定，发现含有乳球菌，且对其进行基因组分析，其富含糖苷水解酶（GH1 和GH3），推测其具有β-glucosidase 和β-galactosidase 活性［23］。Thet 等［6］从牛瘤胃液中筛出一株具有较高滤纸酶活力（FPase）的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。以上说明埃希氏菌属、乳球菌属和肠球菌属的部分菌种具有产纤维素酶的基因，能够分泌纤维素酶，降解纤维素。前期本实验室已对复合菌系M6 进行生理生化试验和酶学特性的研究，发现复合菌系M6 的综合性状优良，适宜于作为青贮添加剂。复合菌系M6 在以水稻秸秆为唯一碳源的诱导培养下，其各酶活力随接种时间的延长不断提高，并在培养第6 天达到最大值，其中木聚糖酶活性显示最高为3.91 U·mL-1。复合菌系M6 能够在无菌培养条件下分泌纤维素酶，并且能高效降解水稻秸秆，构成稳定的微生态体系，因此了解其生长产酶规律，对更好地研究和利用纤维素降解复合菌系具有重要意义。此外，复合菌系M6 纤维素酶活力动态的测定对于后续青贮发酵及实际应用具有重要的指导意义。

为了更加深入地评价复合菌系M6 降解粗纤维的效果，将复合菌系M6 添加到γ 辐射灭菌水稻秸秆青贮中，比较在无其他微生物的干扰条件下，复合菌系M6 对水稻秸秆结构性碳水化合物的降解效果。整个青贮过程中，CK 和CLAB 组乳酸含量呈先上升后下降趋势，表明水稻秸秆自身附着的乳酸菌或添加的外源乳酸菌，在青贮前期可利用发酵底物产乳酸，但是发酵45 d 后，由于水稻秸秆自身附着的乳酸菌或添加的外源乳酸菌中有异型发酵乳酸菌存在，在底物不足的情况下，将乳酸转化为乙酸，使乙酸含量升高。M6 处理组pH 始终低于其他各组，青贮第60 天达到最低值（4.62）。青贮45 d 后，M6 处理组LA 含量始终显著高于其他各组，这表明复合菌系M6 对水稻秸秆青贮发酵品质的改善优于添加乳酸菌的效果，这与费氏评分结果相一致。水稻秸秆在复合菌系M6 的酶解作用下产生水溶性碳水化合物，而M6 中含有31.49%的乳球菌属，乳球菌属的存在可及时利用酶解下游的产物水溶性碳水化合物，产生乳酸，降低pH［24］，同时维持青贮过程中水溶性碳水化合物的含量，消除酶促反应中产物的抑制作用［25］，提高纤维素降解复合菌系的降解效率，进而有效地改善水稻秸秆的发酵品质。

青贮过程中添加纤维素降解复合菌系可有效地降低纤维素的结晶度、增加孔隙和表面积，促进酶与底物相互接触并反应，提高酶解糖化率，释放水溶性碳水化合物，为乳酸菌发酵提供更多的发酵底物［26］。本试验青贮15 d后，水稻秸秆青贮饲料NDF、ADF、纤维素和半纤维素含量在M6 组均低于其他各组，且在第90 天达到最低的NDF（590.15 g·kg-1DM）、ADF（372.63 g·kg-1DM）、纤维素（318.61 g·kg-1DM）和半纤维素（217.52 g·kg-1DM）含量，表明添加复合菌系M6 加速了水稻秸秆结构性碳水化合物的降解。Castro 等［27］研究指出应用木质纤维素降解微生物，可以有效地提高农作物秸秆结构性碳水化合物的降解效率。利用微生物酶解作用降解植物细胞壁中的结构性多糖，破坏其细胞壁结构，使植物细胞壁内可利用的水溶性碳水化合物释放出来，同时也增加了微生物或酶对半纤维素和纤维素的可接触表面积，进一步将结构性多糖降解为单、双糖，供乳酸菌利用，产生LA，降低pH。石伟［28］将3 株筛选于青藏高原野牦牛粪便中的具有较高纤维素酶活性的芽孢杆菌，按一定接种比例与乳酸菌组合后添加至全株玉米青贮30 d 后，其NDF 和ADF 含量分别降低了16.63%和15.85%。

纤维素降解菌的酶解作用可促进水稻秸秆中的结构性碳水化合物的降解，释放出额外的WSC 以补充乳酸菌发酵所需的底物，促进乳酸发酵，降低pH，抑制有害微生物的活性，提高青贮发酵品质［29］。在青贮前15 d，各处理组（除IRR 组外）中WSC、蔗糖、果糖、木糖、纤维二糖和葡萄糖含量迅速下降，其后，M6 和IRR 处理组水溶性碳水化合物含量保持相对稳定的水平。IRR 组各指标表明，将灭菌后水稻秸秆直接青贮其各化学成分无显著变化。纤维素降解复合菌系M6 使得青贮饲料保持了较高水平的WSC 含量，这是由于纤维素降解复合菌系降解结构性碳水化合物释放水溶性碳水化合物所致［30］。丁健等［31］在玉米青贮过程中添加纤维素酶，结果显示添加纤维素酶可产生纤维二糖和麦芽糖，显著增加了六碳糖、五碳糖和衍生糖的含量。添加纤维素降解复合菌系，可以弥补菌株之间的产酶差异，有利于组成完整全面的酶系，充分发挥各酶之间的协同作用，提高纤维素酶的活性和降解能力，使各个菌株相互协调生长，并最大程度发挥复合菌系对结构性碳水化合物的降解能力。根据本试验结果可推断复合菌系M6 在水稻秸秆青贮中具有降解粗纤维和促进乳酸发酵的双重作用。青贮过程中，M6 组乙酸含量明显提高，这可能是由于微生物酶解使半纤维素脱乙酰化，产生五碳糖，部分异型发酵乳酸菌可利用五碳糖发酵成乳酸和乙酸［32］。此外，青贮过程中多聚糖的生物降解会影响乳酸菌发酵效率和代谢途径。新鲜的牧草中游离戊糖很少，而在兼性厌氧纤维素降解复合菌系M6 分泌的半纤维素酶作用下可释放部分戊糖［33］，戊糖（木糖）可部分被乳酸菌利用，从而积累更多的乙酸。综上所述，尽管青贮过程中添加外源微生物（纤维素降解复合菌系或复合乳酸菌），最终发酵品质未达到优质青贮饲料的标准，但在一定程度上促进了乳酸发酵，降低pH 值，改善水稻秸秆青贮发酵品质，其中复合菌系M6 改善效果最佳；在此也进一步提示对于类似于水稻秸秆的青贮原料，水溶性碳水化合物严重不足，仅仅依靠添加外源微生物（纤维素降解复合菌系或复合乳酸菌）提高其发酵品质的策略仍不够，需与添加外源发酵底物相结合，才能达到理想的效果。

4 结论

与水稻秸秆自然发酵或添加复合乳酸菌相比，添加纤维素降解复合菌系M6 降低了水稻秸秆青贮饲料pH值，提高了LA 含量和LA/AA 值，维持了较高的水溶性碳水化合物含量，改善了水稻秸秆青贮发酵品质，复合菌系M6 在水稻秸秆青贮中具有降解粗纤维和促进乳酸发酵的作用，在青贮饲料生产中具有良好的应用前景。