李 强 ,王 刚 ,王 凡 ,李玉庆

1.唐山市协和医院普外科,唐山 063000;2.唐山市协和医院急诊科,唐山 063000

橘红素(tangeretin,Tan)是从枳实等中药中提取的一种多氧甲基黄酮类成分,其对肺癌、胃癌等肿瘤细胞具有一定抑制作用[1]。Tan可能通过抑制细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化和上调细胞周期蛋白B1(cyclinB1)的表达来抑制人胃癌AGS 细胞的增殖,还可通过p53依赖的线粒体途径和Fas/FasL 介导的死亡受体途径诱导胃癌AGS细胞的凋亡[2-4]。研究发现,细胞自噬与胃癌发生、发展过程密切相关[5]。因此,本研究通过探究Tan对人胃癌AGS细胞自噬的作用机制,以期为Tan用于胃癌的防治提供新的实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

7300型荧光实时定量PCR 仪(美国Applied Biosystems公司);IX53型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);JEM-1230型透射电子显微镜(日本JEOL公司)。

1.2 试药

橘红素(质量分数≥98%,上海研生实业有限公司);腺苷酸激活蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]激动剂A-769662(美国Biovision 公司);HAM's/F12 培养液(美国Hyclone公司);Triol试剂、反转录试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司;兔抗人AMPK单抗、p-AMPK 单抗、沉默调节蛋白(silent mating type information regulation 2 homolog-3,SIRT3)单抗、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ单抗均购自美国Cell Signaling Technology 公司;p62 单抗、HRP 标记的山羊抗兔二抗均购自美国Abcam 公司;细胞自噬MDC染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 细胞株

人胃癌AGS细胞株购自美国ATCC(American Type Culture Collection)。

2 方法

2.1 细胞培养

将常规冻存复苏的人胃癌AGS细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的HAM's/F12 培养液中,置于体积分数5% CO2、饱和湿度的培养箱内,37 ℃恒温培养。用质量浓度0.25 g·mL-1胰蛋白酶消化传代,2～3 d传代1次,取处于对数生长期的细胞用于实验。

2.2 MTT 法检测细胞抑制率及细胞形态……

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