董金叶，孙 月，秦 红，朱 琳，鞠 叶#

(1.青岛大学附属妇女儿童医院耳鼻喉科，山东 青岛 266000； 2.中国人民解放军海军第九七一医院耳鼻咽喉科，山东 青岛 266071)

变应性鼻炎(anaphylactic rhinitis，AR)为全世界常见的鼻腔疾病，指发生在鼻黏膜的由免疫球蛋白E(IgE)介导的变态反应性疾病，以鼻痒、打喷嚏及鼻黏膜肿胀为主要表现，为临床常见病和多发病[1]。流行病学调查结果显示，随着生活环境破坏、污染加重等，AR的发病率呈逐年升高趋势[2]。AR会严重影响患者的生活质量，导致情绪障碍及经济负担等，但目前关于AR的治疗只能缓解其症状，因此，积极探索更有效的治疗方案和药物是首要任务。槲皮苷属于天然黄酮苷化合物，目前研究结果显示其具有广泛的治疗效果，不仅在抗心脑血管疾病[3]、免疫调节[4]、神经保护[5]及调节血脂[6]等方面具有良好的药理活性，而且具有抗过敏[7]、抗氧化[8]和抗肿瘤[9]等重要作用。但目前尚无明确研究显示槲皮苷在AR中的确切效果。本研究通过AR模型小鼠，探讨槲皮苷对AR的治疗效果及相关作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

6周龄Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证编号为SCXK(京)2017-0015，小鼠体质量为26～32 g，均为雌性，饲养于SPF级动物房中适应1周，自由摄食进水，相关操作均符合动物医学伦理相关规定。

1.2 仪器

Centrifuge 5420型离心机(德国Eppendorf公司)；DM2700M型显微镜(美国Leica公司)；LSM-900型激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)。

1.3 药品与试剂

槲皮苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号为5280459)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号为H052-1)；Diff-Quik染色试剂盒(西安齐岳生物科技有限公司，批号为148983)；1∶ 400 抗嗅觉标记蛋白(OMP)抗体(上海拜力生物科技有限公司，批号为548985)；4%卵蛋白溶液(北京博奥森生物技术有限公司，批号为AH06C17756)；Al(OH)3(美国Sigma公司，批号为V900163)；乙二胺四乙酸溶液(美国Sigma公司，批号为464534)；PBS缓冲液(美国赛默飞公司，批号为627813)；山羊血清(美国赛默飞公司，批号为c545489)；0.03% Triton X-100封闭液(美国赛默飞公司，批号为5487558)；FITC结合的山羊抗兔二级抗体(美国赛默飞公司，批号为4724869)HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，批号为164135a)；PAS染色试剂盒(美国Sigma公司，批号为1649881)。

2 方法

2.1 卵蛋白诱导的AR小鼠模型和槲皮苷治疗

6周龄雌性Balb/c小鼠在无特定病原体环境中随意获得无菌食物和水。所有动物均按照实验动物护理和使用委员会批准的方案处理。将小鼠随机分为三组(n=10)，即对照组、模型组(卵蛋白)和治疗组(卵蛋白+槲皮苷)。AR小鼠模型建立(模型组)：采用目前国内常用的“卵蛋白注射及其鼻黏膜刺激法”，卵蛋白0.3 mg、Al(OH)330 mg 及0.9%氯化钠溶液1 mL混合后于小鼠腹腔注射初次免疫，第2—14日小鼠正常饲养，第15—21日每侧鼻孔给予4%卵蛋白溶液(20 μL/只)刺激小鼠鼻孔。对照组：腹腔注射Al(OH)3，然后在第15—21日用0.9%氯化钠溶液刺激小鼠鼻孔。治疗组：在模型组基础上，第15—21日每侧鼻孔给予4%卵蛋白溶液(20 μL/只) 刺激小鼠鼻孔，同时在第15—21日每日加用槲皮苷(纯度≥98%)50 mg/kg灌胃。

2.2 过敏症状评估和鼻腔灌洗液样品制备

在第21日最后一次卵蛋白鼻腔刺激后20 min内，对所有小鼠的早期反应(包括鼻摩擦次数和喷嚏次数)进行计数，并以盲法记录，共10 min。在最后一次鼻腔刺激2 h后，采集小鼠血液和鼻腔灌洗液样本，以1 600 r/min离心10 min(离心半径为10 cm)。将血浆和鼻腔灌洗液上清液储存于-80 ℃以进行后续实验。此外，将小鼠颅骨矢状打开，获取鼻中隔及其黏膜，并储存于-80 ℃以进行后续实验。

2.3 组织病理学检查

鼻中隔的标本在10%甲醛中固定24 h；用去离子水清洗后浸泡在乙二胺四乙酸溶液中脱钙3～4周；然后石蜡包埋；组织切片(厚度为3 μm)用苏木精-伊红(HE)染色(用于组织病理学变化的定性评价)、高碘酸-希夫(PAS)染色(用于黏液染色)，在光学显微镜下以400倍放大倍数观察并采集图像。

2.4 检测小鼠鼻腔灌洗液中炎症因子水平

对小鼠鼻腔灌洗液进行炎症因子检测，根据ELISA试剂盒说明书，对三组小鼠鼻腔灌洗液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)4、IL-10和IL-17水平进行测定，重复3次。

2.5 鼻腔灌洗液中细胞分析

将鼻腔灌洗液150 μL以1 000 r/min离心10 min(离心半径为10 cm)后涂片，利用Diff-Quik染色试剂盒进行染色，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和上皮细胞，在光学显微镜下以400倍放大倍数观察并采集图像。

2.6 免疫荧光染色

将鼻中隔切片置于4 ℃、0.01 mo/L PBS缓冲液中，复温15 min后滴加10%山羊血清+0.03% Triton X-100封闭液室温(25 ℃)封闭2 h，组织切片中加入1∶ 400 OMP抗体，置于4 ℃孵育箱中过夜，再用0.01 mol/L PBS缓冲液清洗。37 ℃下用异硫氰酸荧光素结合的山羊抗兔二级抗体孵育30 min，再次洗涤切片，滴加抗荧光衰减封片剂封片后置于4 ℃条件下保存，于激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 槲皮苷可改善AR小鼠的鼻过敏症状

治疗组小鼠用槲皮苷灌胃，持续1周，记录最后1次卵蛋白激发后的鼻摩擦次数和喷嚏次数。结果显示，与对照组相比，模型组小鼠平均鼻摩擦次数显著增加(F=11.76，P<0.001)，而治疗组小鼠平均鼻摩擦次数明显少于模型组(F=9.89，P<0.01)；与对照组相比，模型组小鼠平均喷嚏次数显著增加(F=13.21，P<0.001)，而治疗组小鼠平均喷嚏次数明显少于模型组(F=9.45，P<0.01)，差异均有统计学意义，表明槲皮苷可减轻AR小鼠的鼻过敏症状，见图1。

A.各组小鼠平均鼻摩擦次数；B.各组小鼠平均喷嚏次数；与对照组相比，***P<0.001；与模型组相比，##P<0.01A. average number of nasal rubbing of mice in each group; B. average number of sneezing of mice in each group; vs. the control group, ***P<0.001; vs. the model group, ##P<0.01

3.2 槲皮苷可改善AR小鼠鼻中隔组织病理学形态

与对照组相比，模型组小鼠鼻中隔组织中有明显的杯状细胞增生，且黏液分泌活跃；与模型组相比，治疗组小鼠鼻中隔组织中杯状细胞增生减轻，黏液分泌减少，表明槲皮苷可改善AR小鼠鼻中隔组织病理学形态，见图2。

A.HE染色；B.PAS染色A. HE staining; B. PAS staining

3.3 槲皮苷可降低AR小鼠鼻腔灌洗液中炎症因子水平

与对照组相比，模型组小鼠鼻腔灌洗液中TNF-α(F=12.57)、IL-4(F=14.75)、IL-10(F=13.64)和IL-17(F=11.41)水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.001)；与模型组相比，治疗组小鼠鼻腔灌洗液中TNF-α(F=10.43)、IL-4(F=9.87)、IL-10(F=9.70)和IL-17(F=8.43)水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，表明槲皮苷可抑制AR小鼠的炎症反应，见图3。

A.TNF-α；B.IL-4；C.IL-10；D.IL-17； 与对照组相比，***P<0.001；与模型组相比，##P<0.01A.TNF-α；B.IL-4；C.IL-10；D.IL-17； vs. the control group, ***P<0.001; vs. the model group, ##P<0.01

3.4 槲皮苷可减少小鼠鼻腔灌洗液中细胞数量

与对照组相比，模型组小鼠鼻腔灌洗液中总细胞数和分化细胞(包括上皮细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)显著增加；与模型组相比，治疗组小鼠鼻腔灌洗液中细胞数量均明显减少，见图4。

3.5 槲皮苷可提高小鼠嗅觉上皮细胞中OMP表达水平

对照组小鼠嗅觉上皮细胞中的OMP表达正常，呈现浓绿色；模型组小鼠嗅觉上皮细胞中的OMP表达明显减少；而治疗组小鼠嗅觉上皮细胞中的OMP表达减少得到一定程度的扭转，OMP表达增加，见图5。

图5 各组小鼠嗅觉上皮细胞中OMP免疫荧光染色代表性图像

4 讨论

AR为常见的变态反应性疾病，IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合，导致脱颗粒和释放预先形成的介质，如组胺、白三烯和前列腺素D2，导致血管通透性增加，气道平滑肌收紧，黏液分泌增加；另外，上述介质还可刺激感觉神经，在短时间内出现鼻痒、充血和打喷嚏的感觉，主要病理过程涉及免疫炎症反应的过度激活等[10-11]。中重度AR患者需常年服用抗过敏药以缓解症状，但长期服用抗过敏药可能带来诸多不良反应[12]。中医药是我国治疗过敏性疾病的常用疗法。研究结果表明，中医药治疗AR具有一定的有效性[13]。但其中的作用机制尚无明确报道。

槲皮苷现已被证明具有多种治疗作用，包括抗心脑血管疾病、免疫调节、神经保护、调节血脂、抗氧化及抗肿瘤等[14]。另有研究结果显示，槲皮苷具有抗过敏作用，其可减轻特应性皮炎，可能机制为其具有抗炎和抗氧化活性[15]。本研究探讨了槲皮苷在小鼠AR模型中的作用及相关机制，结果显示,槲皮苷可有效减轻AR小鼠的过敏症状及黏液的产生。黏液分泌增多为变态反应的主要症状，IL-4可增强组胺诱导AR的黏液过度分泌[16-17]。IL-4是由肥大细胞和淋巴细胞产生的重要细胞因子，在过敏性哮喘和AR的发病机制中起着重要作用[18-19]。本研究结果说明槲皮苷可明显减轻AR小鼠局部炎症因子的产生，减轻局部炎症细胞浸润，由此表明槲皮苷可通过减少AR小鼠鼻腔灌洗液中IL-4等炎症因子的表达进而减轻AR症状。

研究结果显示，鼻黏膜上皮细胞中OMP表达的恢复与AR症状减轻密切相关，OMP是反映嗅觉损伤程度较为可靠的指标[20]。因此，本研究对各组小鼠嗅觉上皮细胞中OMP表达的变化进行研究，结果证实，槲皮苷治疗后AR小鼠嗅觉上皮细胞中OMP的表达得到恢复，进一步说明槲皮苷对AR小鼠具有较好的治疗作用。

综上所述，槲皮苷对AR小鼠具有较好的治疗效果，其可通过减轻炎症反应、增加鼻黏膜上皮细胞OMP表达来发挥作用。本研究结果可为AR的临床治疗提供新的诊疗思路及研究基础。