马致洁，董捷鸣，于小红，李 萌，陈 熹，赵奎君，饶 全#，章从恩#

(1.首都医科大学附属北京友谊医院药学部，北京 100050； 2.首都医科大学附属北京友谊医院普外科，北京 100050)

雷公藤为卫矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)的干燥根，因其毒性较大，传统以外用为主，不予内服，直至1974年首次将雷公藤内服用于治疗类风湿关节炎[1]。雷公藤作为一味经典毒性中药，古代医籍中对其炮制方法的记载甚少，现代应用时以净制为主，去除毒性较大的外皮，取毒性较小的木质入药，但仍易出现不良反应以及药物性中毒事件[2-3]。同时，随着皮部有效成分的丢失，其有效性也受到影响。微生物发酵炮制时，微生物中的酶系与雷公藤中的成分发生一系列有机反应，容易改变原有成分或者增加一些新的毒性物质。在传统发酵过程中，由于菌种的不确定性和有毒菌株的混入，难以保障发酵产品质量的均一性和安全性[4-5]。目前公认的炮制减毒方法是以辅料炮制，但在雷公藤炮制减毒方面的研究较少。近期国内学者也系统比较了不同炮制方法对雷公藤药效和肝毒性的影响[6-9]。研究结果表明，在诸多炮制方法中，甘草汁炮制雷公藤增效减毒效果较佳，前期课题组已建立了甘草炮制雷公藤的方法，并证实了甘草炮制减毒的客观性，但减毒机制仍未完全阐释清楚[10-11]。

高迁移率族蛋白1(HMGB1)为存在于哺乳动物组织细胞核内的蛋白。HMGB1可由激活的免疫细胞或坏死细胞释放至胞外，通过Toll样受体4(TLR4)和钙调节通道介导炎症反应，参与免疫性疾病的发生[12-13]。在脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的肝损伤中，HMGB1被释放至胞外，激活树突状细胞，启动适应性免疫应答[14-15]。课题组前期研究结果验证了雷公藤致大鼠肝损伤的机制可能与其激活了HMGB1-TLR4/核因子κB(NF-κB)炎症通路有关[16-17]。本研究继续探讨甘草制雷公藤降低肝毒性与HMGB1介导的炎症通路的关系，以期为阐释甘草炮制雷公藤减毒的作用机制提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

实验动物为SPF级SD大鼠，雄性，4～5周龄，体重(200±20)g，共24只(购自华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：11401300054115)。将大鼠随机分笼饲养于SPF级实验室，4只/笼，保证大鼠有充足的活动空间，期间维持室内温度为25 ℃左右、相对湿度为50±2%，每12 h进行昼夜灯光交替1次。

1.2 仪器

XS205型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；RE-52A型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)；Centrifuge 5424R小型冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)；CKX41型光学显微镜(日本Olympus公司)；BS-300型自动生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；SpectraMax®M3酶标仪(美国Molecular Devices公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2型多功能旋涡混合器(美国Scientific Industries公司)。

1.3 药材与试剂

雷公藤购自福建省三明市，经首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科赵奎君教授鉴定为卫矛科雷公藤的干燥根茎；生甘草饮片(产地：内蒙古；生产批号：SB7131)购自首都医科大学附属北京友谊医院中药房。HMGB1(大鼠)试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；大鼠白细胞介素(IL)1β、IL-2、肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附试验试剂盒购自美国ThermoFisherScientific公司；HMGB1(大鼠)抗体、TLR4(大鼠)抗体均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；NF-κB(大鼠)抗体购自美国CST公司；二抗(山羊抗兔鼠通用)购自以色列Biological Industries生物科技公司；天冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒、丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒均购南京建成生物工程研究所有限公司；其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 雷公藤样品的制备

称取约2 500 g雷公藤生药，切碎为大小约2～3 cm的不规则碎块，取其中1/2(另1/2用于炮制)，按比例称量8倍体积去离子水，用去离子水浸泡30 min；然后用电磁炉煎煮，输出功率维持在1 000 W左右，煎煮40 min；然后用0.25 cm药筛过滤，过滤后再次加入称量好的8倍体积去离子水，再次煎煮40 min，以相同条件过滤，合并两次滤液，将合并后的滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，放入4 ℃冰箱，使用时再稀释。

2.2 甘草炮制雷公藤样品制备

2.2.1 甘草汁的制备：按雷公藤-甘草饮片质量比3∶1来称量所需的甘草片，以8倍体积的水提前浸泡甘草饮片30 min，然后煎煮20 min，用0.25 cm药筛过滤，收集滤液；采用相同方法煎煮3次，用旋转蒸发仪将合并后的滤液浓缩至合适体积，备用。

2.2.2 甘草制雷公藤样品的制备：将上述另1/2已经切碎为2～3 cm碎块的雷公藤生药称量，分批放于1 000 mL烧杯里，加入制备好的甘草汁，以3∶1的质量比浸泡雷公藤生药，常温(25 ℃)过夜，甘草汁需没过雷公藤，使雷公藤充分吸收甘草汁。将浸泡过夜充分吸收甘草汁的雷公藤放入锅内，加热并维持100 ℃，炒制10 min至雷公藤表面不粘手，得到甘草制雷公藤样品。使用“2.1”项下方法制成甘草炮制雷公藤的水煎剂，临用前配制成相应浓度(给药剂量以雷公藤生药量计)。

2.3 动物分组与给药

将24只SD大鼠随机分为3组，分别为空白对照组、雷公藤组(相当于生药16 g/kg)和甘草炮制雷公藤组(相当于雷公藤生药16 g/kg)。给药组大鼠连续灌胃给药3周，空白对照组大鼠灌胃相同体积的0.9%氯化钠溶液。

2.4 动物取材及指标检测

每隔7 d于大鼠尾静脉取血，采用酶联免疫吸附试验检测血清中肝脏生化指标AST和ALT水平；末次给药结束，取血检测大鼠血清中炎症因子HMGB1、IL-1β、IL-2和TNF-α水平；末次给药结束后(第21日)，取大鼠肝脏组织，一部分放入配好的福尔马林里为苏木精-伊红(HE)染色切片备用；另一部分放入液氮中，采用蛋白质印迹法检测肝脏组织中HMGB1、TLR4和NF-κB的表达。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 血清中ALT、AST含量检测结果

给药1周，空白对照组、雷公藤组和甘草炮制雷公藤组大鼠组间ALT、AST含量的差异无统计学意义(P>0.05)。雷公藤组大鼠给药2周后的血清ALT、AST含量高于空白对照组(P<0.05)，给药3周后显著高于空白对照组(P<0.01)；同时雷公藤组大鼠给药2周后的血清ALT、AST含量高于甘草炮制雷公藤组(P<0.05)，且给药3周后显著高于甘草炮制雷公藤组(P<0.01)，上述差异均有统计学意义，见表1。甘草炮制雷公藤组大鼠血清AST含量在给药3周后高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；ALT含量在不同给药时间与空白对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 三组大鼠血清ALT、AST含量的检测结果比较

3.2 血清中炎症因子检测结果

与空白对照组相比，雷公藤组大鼠的血清TNF-α、IL-1β和HMGB1含量均升高(P<0.01)，血清IL-2含量升高(P<0.05)，差异均有统计学意义，见表2。甘草炮制雷公藤组大鼠与空白对照组上述血清炎症因子含量的差异均无统计学意义(P>0.05)；与雷公藤组相比，甘草炮制雷公藤组大鼠血清TNF-α、IL-1β和HMGB1含量明显降低(P<0.01)，血清IL-2含量降低(P<0.05)，差异均有统计学意义，见表2。

表2 三组大鼠血清炎症因子检测结果比较

3.3 肝组织中HMGB1炎症通路中关键蛋白表达检测结果

与空白对照组相比，雷公藤组大鼠肝脏中HMGB1、TLR4和NF-κB表达均升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与空白对照组相比，甘草炮制雷公藤组大鼠TLR4、NF-κB表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；甘草炮制雷公藤组大鼠HMGB1表达与空白对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与雷公藤组相比，甘草炮制雷公藤组大鼠TLR4、NF-κB表达降低(P<0.05)，HMGB1表达显著降低(P<0.01)，差异均有统计学意义，见表3、图1。

A.空白对照组；B.雷公藤组；C.甘草制雷公藤组Note: A. blank control group; B. Tripterygium wilfordii group; C. licorice-processed Tripterygium wilfordii group

表3 三组大鼠肝脏组织中HMGB1通路相关蛋白条带灰度值比值结果比较

3.4 肝组织病理学观察结果

空白对照组大鼠肝脏组织HE染色均匀，肝脏小叶结构清晰，呈放射状紧密排列，肝细胞形态良好；雷公藤组大鼠肝脏小叶排列紊乱，肝窦轻度扩张，部分肝细胞胞浆内可见圆形空泡和脂肪变性，局部区域出现点状炎症浸润灶；甘草炮制雷公藤组大鼠肝脏组织HE染色均匀，肝脏小叶结构清晰，呈放射状排列整齐，肝细胞形态良好，无明显肝损伤表现，见图2。

A.空白对照组(×40)；B.空白对照组(×200)；C.空白对照组(×400)；D.雷公藤组(×40)；E.雷公藤组(×200)；F.雷公藤组(×400)；G.甘草炮制雷公藤组(×40)；H.甘草炮制雷公藤组(×200)；I.甘草炮制雷公藤组(×400)A.blank control group(×40)；B.blank control group(×200)；C.blank control group(×400)；D.Tripterygium wilfordii group(×40)；E.Tripterygium wilfordii group(×200)；F.Tripterygium wilfordii group(×400)；G.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×40)；H.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×200)；I.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×400)

4 讨论

雷公藤在自身免疫性疾病尤其是类风湿关节炎治疗中的效果尤为显著[17]。研究结果表明，低剂量使用雷公藤红素具有显著的减肥效果，应用前景广泛[18]。但由于雷公藤的活性成分同时也是其毒性成分，导致临床应用过程中极易出现不良反应，近年来报道的药物性肝损伤事件中，雷公藤位列单味中药之首[19]。雷公藤的不良反应限制了其在临床中的应用和发展，因此，雷公藤的减毒存效研究极为重要。在中医药理论指导下，深入研究雷公藤毒性发生的机制，通过不同炮制配伍方法降低毒性，并保持或提高雷公藤的疗效，是合理开发应用雷公藤的重要课题。近年来，课题组一直致力于雷公藤的毒性及药效学的研究。根据中药药性理论，甘味药可以缓和药性。甘草有“解百草毒”之名，“得中和之性，有调补之功”，被《神农本草经》列为上品[20]。《黄帝内经》中提出“肝苦急，急食甘以缓之”，雷公藤的肝毒性可佐以甘草缓之，起到养护肝脏之效[21]。因此，利用甘草炮制雷公藤增效减毒符合中医传统理论。前期研究中，课题组发挥甘草汁炮制毒性中药的优势，结合甘草保肝的现代研究成果，开展甘草汁炮制雷公藤降低肝毒性的研究，建立了甘草汁炮制雷公藤的方法，并证实了甘草炮制降低肝毒性的作用[10-11,16-17,22-23]。

HMGB1是一种重要的促炎因子，其主要受体为TLR和晚期糖基化终端产物受体[12]。研究结果表明，在多种肝损伤疾病中，HMGB1表达水平明显升高。HMGB1在炎症反应中被释放，迁移到胞外，与相应受体特异性结合，通过调节NF-κB入核，激活下游因子的表达，来促进炎症发生[24-28]。课题组前期已证实雷公藤的肝毒性与其激活HMGB1通路有关，本研究在此基础上进一步研究了甘草炮制雷公藤降低肝毒性与HMGB1通路的关系，为解释甘草炮制雷公藤减毒的机制提供依据。当

然，甘草炮制雷公藤减毒还有其他减毒的内在机制，包括化学成分的改变、体内靶点的改变等，需要继续研究和探索。另外，在关注雷公藤减毒的前提下，也应关注其药理活性，在合理避毒的情况下，充分发挥雷公藤的强大免疫抑制能力才是最终目的，课题组后期会持续进行相关研究。