庞连慧，罗双双，石林林，陈天圣，刘红，王焕岭

1.华中农业大学水产学院/农业农村部淡水生物繁育重点实验室，武汉 430070；2.集美大学水产学院/农业农村部东海海水健康养殖重点实验室，厦门 361021

鱼类性腺成熟是生殖细胞不断增殖、分化成成熟配子的过程，而配子的成熟需要经过2次减数分裂，其中涉及了同源染色体的配对、联会、重组和分离等，其中任何环节的异常都会导致减数分裂过程无法正常进行，进而导致配子发育的异常[1]，因此，这个过程需要精确而复杂的分子调控。细胞分裂周期蛋白20（cell division cycle 20 homolog，CDC20）是细胞周期、有丝分裂和减数分裂的重要调节因子[2]。据报道，不同物种CDC20蛋白的结构域十分保守，一般含有7个WD40基序形成稳定的7叶螺旋桨状结构，作为支架介导泛素结合酶与底物之间相互结合[3]。在卵母细胞减数分裂中，CDC20蛋白是同源染色体分离的关键因子，通过影响减数分裂的重要调控蛋白——后期促进复合物（anaphase promoting complex/cyclosome，APC/C）的活性促进Ⅱ期姐妹染色体分离。研究发现CDC20蛋白表达量降低会导致小鼠受精卵几乎不能正常发育[4]，而其蛋白失活会引起胚胎死亡[5]。在人类中，CDC20基因的突变导致女性不育[6]和男性的生殖能力降低[7]。这些研究表明CDC20在动物生殖、胚胎发育中发挥重要作用。目前，CDC20的功能研究在鱼类中尚未涉及。因此，为了解鱼类cdc20基因的功能，本研究以团头鲂为试验对象，对其cdc20基因的序列特征、系统进化和时空表达模式进行初步研究，旨在为后续的基因功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 团头鲂总RNA的提取与cDNA合成

使用TRIzol（康为世纪生物科技股份有限公司）提取团头鲂成鱼不同组织的总RNA，包括脑、眼睛、鳃、心脏、肝脏、脾脏、肠、肾脏、卵巢、精巢和肌肉。采集不同发育时期（受精卵、2-细胞期、16-细胞期、囊胚期、原肠期、神经期、体节期、心跳期和孵化期）的胚胎并提取总RNA。将提取的总RNA用Prime-Script®RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKa-Ra）试剂盒进行反转录合成第一链cDNA。

1.2 团头鲂cdc20基因的克隆和进化分析

将斑马鱼的cdc20cDNA序列（Accession：NM_213080）与笔者所在实验室的团头鲂转录组数据进行比对，获得团头鲂cdc20基因的编码区序列。并根据此序列使用Oligo 7和Beacon Designer 7软件设计PCR引物以扩增团头鲂cdc20基因的编码区序列。根据预测的氨基酸序列利用ClutsalX软件进行多序列比对以及使用SWISS在线网站（https：//swissmodel.expasy.org/）预测蛋白结构域；基于MEGA 6.0软件的Neighbor-joining方法构建进化树。

1.3 sqRT-PCR

采用sqRT-PCR方法检测cdc20基因在团头鲂成鱼各组织中的表达模式，以β-actin作为内参基因，引物序列见表1。PCR条件如下：95℃5 min；95℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增结束后，取10 μL PCR产物，使用1%的琼脂糖凝胶，140 V电压下电泳15 min，检测该基因在各组织中的表达量。

表1 本研究所用引物Table 1 All primers used in this study

1.4 qRT-PCR

使用SYBR®Green qPCR Mix试剂盒，在CFX96 Real-Time PCR Dectection System中进行qRT-PCR。每个样品3次重复，以β-actin作为内参基因。以团头鲂不同发育时期胚胎的cDNA为模板，参照下列反应体系进行PCR扩增：模板cDNA 1 μL，正向引物和反向引物各0.4 μL；SYBR®Green qPCR Mix 10 μL，ddH2O 8.2 μL。反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，39个循环；72℃5 min。结果通过2-ΔΔCt法计算cdc20的相对表达量，数值用“平均值±标准差”（n=3）表示，用GraphPad Prism 8软件作图。采用单因素方差分析方法（ANOVA）和Duncan’s检测mRNA表达水平的差异，当P＜0.05时，认为差异显著。

1.5 性腺组织切片H.E染色及观察

团头鲂的性腺组织用4%PFA（DEPC水处理）固定后送武汉赛维尔公司做切片，依次将切片进行如下操作：二甲苯洗2次，每次20 min；无水乙醇洗2次，每次10 min；95%乙醇5 min；90%乙醇5 min；80%乙醇5 min；70%乙醇5 min；蒸馏水冲洗后，苏木素染色3～8 min，自来水洗；1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗；0.6%氨水返蓝，流水冲洗；伊红染液中染色1～3 min；将切片放入95%乙醇洗2次，每次5 min；无水乙醇洗2次，每次5 min；二甲苯洗2次，每次5 min，切片拿出来稍晾干，中性树胶封片。以上操作完成后于显微镜（Leica，DFC550）下观察。

1.6 切片原位杂交

以团头鲂cdc20cDNA序列作为模板，设计探针引物（表1），在反向引物的5′端加上T7启动子序列，并参照下列反应体系进行体外转录：DNA模板1 μg，10×transcription buffer 2 μL，T7/SP6 RNA 聚合酶2 μL，DIG-NTP Mix 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，RNase-free水加至20 μL；体系混匀后，37℃水浴4 h后完成体外转录，合成的探针大小为342 bp。利用石蜡切片进行原位杂交，具体如下：二甲苯洗5次，每次5 min；二甲苯∶无水乙醇（体积比）=1∶1洗2次，每次3 min；无水乙醇洗2次，每次3 min；依次用95%、90%、85%、75%、50%乙醇各洗1次，每次3 min；85℃DEPC水洗3 min；滴加65℃预热的预杂交液，预杂交1～2 h；然后将5 ng/μL探针滴加到组织块上，放入湿盒，65℃杂交过夜；用2×SSCT 65℃清洗切片2次，每次30 min；0.2×SSCT 65℃清洗切片15 min，50%甲酰胺/2×SSCT 65℃清洗切片2次，每次30 min；用5%的羊血清封闭1～2 h；二抗（Anti-Digoxigenin-AP）室温孵育 1.5 h；滴加 BCIP/NBT（1 mL平衡液加4.5 μL NBT和3.5 μL BCIP）染色；显色完成后置于显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 团头鲂cdc20基因的分子特征和进化分析

通过PCR测序及生物信息学分析证实团头鲂cdc20编码区的基因组长3 960 bp，包含10个外显子和9个内含子，cDNA长1 482 bp，编码493 aa；预测蛋白的理论分子质量为5.44 ku，等电点为7.68。氨基酸序列多重比对结果显示（图1），团头鲂Cdc20与鲤和斑马鱼的相似度分别高达95.74%和90.12%，与大鼠、人类和非洲爪蟾的相似度分别为59.96%、59.36%和63.58%。结构域分析显示Cdc20有7个WD40重复基序，且该基序在不同物种中都相对保守，进一步分析发现每个WD40基序形成4股反向平行β折叠，7个WD40基序构成稳定的7叶螺旋桨状结构（图2）。

图1 团头鲂Cdc20蛋白的多序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment of Cdc20 proteins of Megalobrama amblycephala

图2 团头鲂Cdc20蛋白预测的三级结构Fig.2 Predicted structure model of M.amblycephala Cdc20 protein

基于多个物种Cdc20氨基酸序列的系统进化分析显示，团头鲂与鲤的系统进化关系最近，其次是斑马鱼。而亲缘关系较远的两栖类、鸟类和哺乳类形成一个独立分支（图3）。

图3 脊椎动物CDC20蛋白的系统进化树Fig.3 Phylogenetic analysis of the protein sequences of CDC20 in vertebrates

2.2 团头鲂cdc20在成鱼各组织和胚胎发育各时期的表达

通过sqRT-PCR检测cdc20基因在团头鲂成鱼不同组织中的表达情况，结果如图4所示，cdc20mRNA在脑、鳃、心脏、脾脏、肠道、肾脏和肌肉中有微弱的表达，而在卵巢和精巢中表达量最高，说明cdc20可能与团头鲂性腺发育有关。

图4 团头鲂cdc20基因在成鱼各组织中的表达Fig.4 Expression of cdc20 gene in different tissues of M.amblycephala

通过qRT-PCR检测cdc20在团头鲂各发育阶段胚胎中的表达情况，包括受精卵、2-细胞期、16-细胞期、囊胚期、原肠期、神经期、体节期、心跳期和孵化期。结果（图5）显示该基因在受精卵中的表达水平最高，随着胚胎发育的进行，其表达量呈逐渐下降的趋势，推测团头鲂cdc20可能是1个母源基因，对维持胚胎的早期发育具有重要作用。

图5 团头鲂cdc20基因在胚胎发育各时期中的表达Fig.5 Expression of cdc20 gene at different embryonic development stages of M.amblycephala

2.3 团头鲂cdc20在生殖细胞中的表达模式

根据团头鲂性腺切片原位杂交的结果（图6），cdc20基因在Ⅰ期卵母细胞信号最弱。卵母细胞进入Ⅱ期后，其表达量开始升高，且在卵母细胞的胞质内表达，而在皮质泡和细胞核中几乎没有表达。而在Ⅲ期卵母细胞的卵黄颗粒中检测到了强烈的探针信号，但细胞核中信号较弱。Ⅳ期卵母细胞中充满了卵黄颗粒，观察不到细胞核和皮质泡，cdc20基因在Ⅳ期卵母细胞的卵黄颗粒中表达，而在放射带几乎不表达。与H.E染色（图7A）对比，基于精巢切片原位杂交的结果显示，在精原细胞以及生精小管的生殖上皮中该基因的表达量最高，而在成熟精子中的表达量低（图7B）。

图6 cdc20基因在团头鲂不同发育时期卵母细胞中的表达Fig.6 Expression of cdc20 gene at different development stages of M.amblycephala oocytes

图7 团头鲂cdc20基因在精巢中的表达Fig.7 Expression of cdc20 gene in testis of M.amblycephala

3 讨论

CDC20蛋白通过C端的WD40结构域（即WD40基序）识别、激活和结合APC/C调节细胞分裂中姐妹染色体的分离[8]，被认为是生殖细胞成熟的重要调节因子[9]，在生物体生长和生殖中发挥重要作用。WD40蛋白最早在牛的G蛋白β亚基中发现[10]，该蛋白的7个WD40基序形成稳定的螺旋桨状结构[11]，参与信号转导、染色质组装、凋亡、细胞周期调控等过程[12]。本研究发现团头鲂Cdc20包含的7个WD40基序可形成7叶螺旋桨状结构，这种特殊的结构形成稳定的支架，为蛋白质的识别和组装提供位点，并增强蛋白之间的互作[12]。氨基酸序列和结构域的保守性说明团头鲂cdc20基因可能与在小鼠、人类中的功能相类似，参与了细胞周期调控、有丝分裂和减数分裂的过程。

本研究还发现，团头鲂cdc20主要在性腺中表达。类似地，有研究发现cdc20基因在斑马鱼性腺中高表达，且对斑马鱼卵子和精子发生过程具有重要作用[13]。在其他物种中，该基因同样与生殖相关。小鼠CDC20蛋白表达量的降低导致雌性失去生殖能力[5]，人类CDC20基因发生突变导致女性不孕[6]和男性无精子症[7]。因此，我们推测团头鲂cdc20基因可能参与生殖和性腺发育。另外，本研究发现在卵巢成熟过程中，随着卵母细胞的发育，该基因的表达量逐渐升高，这与在猪卵母细胞中的表达一致[14]。而精巢切片的原位杂交结果与卵巢相反，cdc20在精原细胞中的表达量最高，而在发育成熟的精子中表达量最低。这些研究结果说明，cdc20基因可能在团头鲂卵巢和精巢中发挥的功能不同，在卵巢中可能参与卵母细胞的成熟过程，而在精巢中对精原细胞早期的形成具有重要作用。

此外，团头鲂cdc20在胚胎发育早期大量表达，然后逐渐下降，因此推测该基因是一个母源基因，对早期胚胎发育具有重要意义，包括激活卵子、促进早期的卵裂、促进合子基因的表达等[15]。在秀丽隐杆线虫中的研究发现，CDC20蛋白与APC/C复合物结合后参与母源因子卵母细胞成熟蛋白（oocyte maturation proteins，OMA）介导的卵母细胞到早期胚胎发育的过程[16]。此外，有文献报道APC/C复合物是一个母源因子[17]，而APC/C复合物的激活需要CDC20蛋白，由此推测CDC20蛋白存在于胚胎发育的早期。这些结果说明团头鲂cdc20可能是1个母源基因。

综上，本研究克隆并分析了团头鲂cdc20基因的序列特征及其时空表达模式，结果可为后续深入研究该基因的功能奠定理论基础。