石妍玉 曲婉彤 张泽鹏 陈颖

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2长春中医药大学附属医院心病中心)

动脉粥样硬化(AS)是由脂质蓄积引发的慢性动脉血管壁炎症性疾病，是心血管疾病的主要病理学基础。目前我国约有 3.30 亿心血管病患者〔1〕，已经成为城乡居民的第一位死因，是我国面临的重大公共卫生问题，因此干预AS迫在眉睫。巨噬细胞在AS的发生发展过程中具有至关重要的作用〔2〕。巨噬细胞可分为经典活化的M1型、选择性活化的M2型。研究发现，可通过抑制M1型巨噬细胞极化，促进M2型巨噬细胞极化，延缓AS斑块形成〔3〕。AS的关键病机是“痰瘀伏络”，本研究因而创立了以益气化瘀、豁痰通络解毒为核心治法的参红通络方。既往研究表明参红通络方〔4，5〕能够缩小斑块面积，降低斑块内凋亡细胞指数，抑制巨噬细胞炎症因子的活化而实现对AS斑块周围炎症的控制，但其具体作用机制尚未完全明确。鉴于巨噬细胞发生极化后可调控炎症因子的活化，对介导炎症的发生与发展具有重要作用。因此，本研究通过检验参红通络方对AS模型小鼠巨噬细胞极化的影响，探讨该方防治AS的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择健康雄性ApoE-/-小鼠及C57BL/6小鼠，SPF级，6周龄，每组各10只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011，于长春中医药大学动物实验中心二层SPF级小鼠饲养室中饲养。动物照明时间8∶00～20∶00，昼夜交替12 h/12 h，温度为(22±2)℃，湿度为45%～70%。本实验由长春中医药大学动物实验伦理委员会审核通过，批准编号20190048。

1.2主要试剂及仪器 人参、丹参、红景天、金银花、赤芍、瓜蒌、当归、降香购自长春中医药大学附属医院药房；油红染夜、苏木素染液、伊红染液、二氨基联苯胺(DAB)显色剂、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂、RIPA裂解液购自Servicebio；兔抗分化簇86(CD86)、甘露糖受体(CD206)、一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶(Arg)1及鼠抗β-actin等抗体购于英国Abcam 公司。Donatello脱水机及Giotto染色机(DIAPATH)；D1008E掌上离心机、G6004载玻片；D3024R台式高速冷冻离心机(DRAGONLAB)；E100显微镜(Nikon)；-80℃超低温冰箱和高压湿热灭菌锅(Sanyo)。

1.3饲料制备 普通维持饲料购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，批号：SCXK(辽)2018-0001；高脂饲料(40 kCal%脂肪,1.25%胆固醇,0.5%胆酸)购自Research Diets公司，型号为D12109C。

1.4动物分组、造模及给药 40只ApoE-/-小鼠按照随机数字表法分为模型组、参红通络方低、中、高剂量组，取遗传基因相同的C57BL/6小鼠10只为空白对照组，适应性喂养1 w后，按照组别分别给予高脂饲料或普通饲料喂养7 w后，除空白对照组外，各组随机抽取1只，取主动脉整体及主动脉窦进行大体油红O染色及苏木素-伊红(HE)染色，以观察造模情况。造模成功后，治疗组分别给予参红通络9、18、36 g/kg每日灌胃给药，给予模型组、空白对照组小鼠等量生理盐水灌胃，持续8 w后，小鼠禁食12 h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后取小鼠主动脉，剪下连有心脏的部分胸段主动脉。

1.5检测指标 ①大体油红O染色观察小鼠主动脉整体的斑块形成情况。将目的区域的血管分离，尽可能去除脂肪组织，组织经过固定、剖开、染色后，镜下观察并拍照留存。结果判读：脂滴呈橘红色或鲜红色。②HE染色观察小鼠主动脉窦的斑块形成情况。取小鼠主动脉使用生理盐水浸洗，放入4%多聚甲醛，固定过夜，清洗，脱水，放入石蜡溶液中包埋，冷却凝固后将蜡块连续切取厚度4 μm的组织切片，然后依次进行贴片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片后拍照留存。③免疫组化(IHC)法检测CD86、CD206的表达水平。将石蜡切片使用柠檬酸盐修复液95℃修复后，血清封闭，滴加一抗，4℃孵育过夜，滴加二抗，DAB显色，各步骤间磷酸盐缓冲液(PBS)4 min×5次充分洗涤，苏木素复染6 min，脱水、透明、封片，使用显微镜观察并拍照留存。④Western印迹法检测小鼠主动脉组织中iNOS、Arg-1蛋白的表达水平。提取组织蛋白并蛋白定量后，准备电泳，转膜，加脱脂牛奶，按说明书加一抗稀释、加入三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水与补间(TBST)，将二抗稀释、孵育，而后洗脱，全部完成后进行化学发光，分析凝胶图像，用Image-Pro Plus6.0软件分析目标带的光密度值。

1.6统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1参红通络方对小鼠主动脉整体斑块形成的影响 如图1所示，可以观察到空白对照组主动脉整体无明显斑块的形成；模型组主动脉整体有明显红色斑块形成；与模型组相比，参红通络方低、中、高剂量组小鼠主动脉整体红色斑块面积均有不同程度的减少。定量分析结果显示，模型组主动脉整体平均斑块占比为(44.25±5.18)%，参红通络低、中、高剂量组主动脉平均斑块占比分别为(30.58±3.26)%、(24.61±4.13)% 和(28.59±1.72)%，与模型组比较显著降低(P<0.05)；参红通络中剂量组主动脉整体斑块占比最低，与参红通络低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 各组主动脉血管大体油红O染色结果

2.2参红通络方对小鼠主动脉根部斑块形成的影响 如图2，空白对照组小鼠主动脉内壁边缘整齐，结构清晰，无斑块；模型组小鼠主动脉内壁可见明显斑块凸起，坏死核心形成。与模型组相比，参红通络方各剂量组均呈现不同程度的改善。定量分析结果显示，模型组主动脉窦斑块占比达(55.13±9.81)%；参红通络低、中、高剂量组斑块占比分别为(43.20±2.22)%、(31.08±5.25)%和(33.98±5.06)%，与模型组比较显著降低(P<0.05)。

2.3参红通络方对CD86、CD206的表达水平的影响 如图3，与空白对照组相比，模型组主动脉组织中CD86含量显著升高(P<0.01)，而CD206 含量明显降低(P<0.01)。与模型组比较，参红通络方低、中、高剂量组主动脉组织中CD86含量均显著降低(P<0.05)，而CD206含量均升高(P<0.05)。与参红通络方低剂量组相比，参红通络方中剂量组提高CD206表达水平的效果最佳，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3、表1。

图2 各组主动脉根部HE染色(×160)

图3 各组主动脉组织CD86、CD206表达(IHC，大图×160，右下角图×480)

表1 各组主动脉组织CD86、CD206的表达情况

2.4参红通络对iNOS、Arg-1蛋白表达水平的影响 与空白对照组相比，模型组主动脉组织中iNOS蛋白表达水平明显增高(P<0.05)，而Arg-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，参红通络低、中、高剂量组主动脉组织中iNOS蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，Arg-1蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。参红通络中剂量组提高Arg-1蛋白表达水平的效果最好，与参红通络低剂量组相比有统计学意义(P<0.05)。见图4、表2。

1～5:空白对照组，模型组，参红通络低剂量组，参红通络中剂量组，参红通络高剂量组图4 各组主动脉组织iNOS和Arg-1的蛋白表达

表2 各组主动脉组织iNOS、Arg-1表达比较

3 讨 论

中医根据症状及体征把AS归为“瘀证”“脉痹”“胸痹”等疾病范围。中医认为AS是由很多因素造成，其主要成因与饮食不当、情志失调、年老体弱、外邪侵袭等密切相关，其病机为气、血、津液紊乱，脏腑功能失调而形成痰、饮、瘀、毒，多属本虚标实，虚实夹杂之证，本虚为气虚、阴虚、阳虚，标实则为痰浊、血瘀、热毒〔6〕。国医大师任继学教授认为伏邪具有“邪伏虚处，待时而发，反复发作，不易去除”的特点，是慢性疾病的共同病因〔7〕，认为“痰瘀伏络”是AS的核心病机。因此，参红通络方由人参、丹参，红景天、金银花、赤芍、瓜蒌、当归、降香等8味中药配伍组成，其中人参以健脾补肺，丹参以补血活血，红景天以活血通络，金银花以清热解毒，赤芍以行血活血，瓜蒌以清热化痰，当归以祛瘀止痛，降香以缓急止痛，共同达到益气化瘀、豁痰通络解毒的功效。根据现代药理学研究，人参皂苷Rb〔8〕可促进白细胞介素(IL)-4和IL-3的分泌，使信号转导及转录激活蛋白(STAT)6发生磷酸化，促进M2巨噬细胞极化，从而发挥抗AS的作用，丹参酮ⅡA〔9〕能够促使M2型细胞分泌抗炎因子,抑制M1型细胞分泌促炎因子,从而达到抗AS作用，红景天苷〔10〕可能通过调节血脂代谢、调整巨噬细胞M1/M2分型极化达到抑制炎症反应、稳定斑块的作用，金银花〔11〕主要的有效药理成分是绿原酸，绿原酸通过抑制炎症反应及脂质堆积来发挥抗AS的作用，赤芍总苷〔12〕通过抑制心肌细胞凋亡、 清除氧自由基等作用来抗AS，瓜蒌〔13〕主要成分为皂苷及氨基酸，具有扩张动脉，营养心肌等作用，当归可以增加心肌细胞的血流量，抗血栓形成，抑制血小板聚集，降香〔14〕能够调节脂肪酸氧化与糖代谢，维持心肌能量代谢平衡，从而保护心肌。

AS是临床上一种累及大、中动脉的炎症性疾病。在AS血液循环中，单核细胞迁移到动脉易损部位并黏附到活化的内皮细胞及内皮细胞间隙中，在局部产生趋化因子迁移到内膜下层，转变为巨噬细胞，之后，一些炎症介质诱导巨噬细胞表面表达清道夫受体，使巨噬细胞大量吞噬氧化修饰的脂蛋白形成泡沫细胞，脂质负荷的泡沫细胞死亡，形成坏死脂质核心，其上覆盖平滑肌细胞分泌的基质蛋白质形成的纤维帽，形成AS斑块〔15〕。本研究结果显示，参红通络方能够有效抑制主动脉整体及主动脉窦斑块形成，有效减少脂质堆积并减少胶原纤维的形成，抑制AS病变的进展，达到抗AS的效果。

M1型巨噬细胞大部分是由脂多糖、干扰素γ等细胞因子诱导分化，能够高表达CD86、iNOS等，与斑块发生、进展及斑块不稳定息息相关。其主要原因为M1型巨噬细胞能够分泌多种促炎因子及促炎介质，使内皮细胞损伤，促进一氧化氮等活性氧的合成，进一步加重氧化应激反应，促使细胞凋亡，加快斑块钙化，进而促进AS的发展。同时，M1型巨噬细胞还能够释放基质金属蛋白酶，使细胞外基质的合成与分解处于失衡状态，明显使斑块内纤维帽变薄，从而大大增加了斑块的不稳定性，甚至导致斑块破裂，从而加速了心血管不良事件的发生，而由IL-4、IL-10等细胞因子诱导分化的M2型巨噬细胞，高表达IL-1、IL-10、CD206、Arg-1等，具有吞噬、促血管生成及促进组织修复，减少炎症反应，维持斑块稳定，进而延缓AS的发生发展〔16，17〕。在AS不同阶段，不同亚型的巨噬细胞比例一直处于动态变化当中。已有研究表明，在AS发展期，M1型和M2 型巨噬细胞的数量均增加，其中，M1型巨噬细胞主要在易损斑块肩部聚集〔18〕，而M2 型巨噬细胞主要存在于稳定的斑块区域中〔19〕，在AS进展期，斑块以M1型为主，在AS消退期，斑块以M2 型为主，因此，可以认为当斑块处M2型巨噬细胞的数量超过M1型巨噬细胞的数量时，斑块可能会更加稳定，不容易发生斑块破裂现象，从而延缓了AS的发展〔20〕。本研究证实了参红通络方能够有效降低M1型巨噬细胞的表达，提高M2型巨噬细胞的表达，改善巨噬细胞的极化比例，抑制血管内炎症反应，明显缩小斑块面积，有效增加斑块的稳定性，进而延缓AS进程，达到抗AS的目的。

综上所述，参红通络方通过减少M1型促炎巨噬细胞的极化，增加M2型抗炎巨噬细胞极化，缩小斑块面积，维持斑块的稳定性，进而发挥抗AS的作用，进一步为临床研究该方提供了新的实验依据，但该方具体通过何种途径干预巨噬细胞极化仍待深入研究。