荆湛 魏巍

(佳木斯大学附属第一医院骨外二科，黑龙江 佳木斯 154002)

2020年全球肺癌新发病例数约为220万，死亡病例数约为180万，肺癌是全球癌症致死的首位原因，占癌症致死总数的18%〔1〕。按照病理特征的不同肺癌可以分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌发病率高，占90%以上，小细胞肺癌发生转移的比例更高，预后更差〔2〕。目前可用于治疗肺癌的方式很多，包括放化疗、手术治疗、靶向治疗等，但是其5年生存率仍然低于20%〔3〕。因此寻找肺癌骨转移早期诊断的生物标志物对早期诊断肺癌骨转移尤为重要。小分子非编码RNA(miRNA)，长度为17～25 bp，其异常表达与许多癌症相关，如肺癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌等〔4～7〕。miRNA的作用主要是调节靶基因，是相应靶基因的上游因子，故它有可能成为早期癌症诊断的生物标志物和治疗靶点。本文通过基因表达数据集GEO2R数据分析GSE47056芯片结果，筛选出特异性高表达的miR-550a-5p，通过体内体外实验验证其在老年性肺癌骨转移中的临床意义。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取佳木斯市肿瘤结核医院与佳木斯大学附属第一医院2019年10月至2021年10月临床病理确诊为肺癌的中老年患者101例。纳入标准:①均经病理证实为肺癌，年龄不低于50岁；②术前未行放、化疗等抗肿瘤治疗；③临床资料、随访资料完整。排除标准:①伴有其他原发性恶性肿瘤；②伴心、肝、肾等重要脏器严重衰竭者;③伴自身免疫性疾病者;④伴精神疾病者。年龄50～89岁，中位年龄67岁；病理类型:小细胞肺癌26例，腺癌50例，鳞癌24例，其他1例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期59例，Ⅲ～Ⅳ期42例。另外以本实验室同学作为健康对照，其中女6例，男6例，年龄21～35岁，中位年龄25岁。本研究经医学伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。

1.2研究方法与检测指标 采用血常规收集管取患者外周血2 ml，1 000 r/min离心15 min，分离血清250 μl置于1.5 ml无RNA酶离心管内，标记并置于-80℃低温保存，采用试剂盒成批提取miRNA。采用柱式 miRNA 抽提试剂盒(购自上海生工生物公司)提取，使用加尾法反转录miRNA，通过miRNA增强型第一链合成cDNA试剂盒(购自北京天根生物公司)合成cDNA。按染料法荧光定量PCR试剂盒(购自北京天根生物公司)扩增检测。miR-550a-5p引物序列为：上游引物：5′-AGTGCCTGAGGGAGTAAGAGCCC-3′；U6作为内参，引物序列为：上游引物：5′-ATGGACTATCATA TGCTTACCGTA -3′，下游引物为反转录试剂盒下游通用引物。反应体系：2×miRNA qPCR master mix 10 μl；上下游引物各0.5 μl；cDNA 2 μl；ROX Reference Dye(H)1 μl；无RNA酶水6 μl；荧光定量 PCR仪检测。每样本平行3次实验重复。根据CT值进行对数(2-△△Ct) 计算。

1.3体外验证miR-550a-5p作用 A549细胞株由本实验室保存。37℃，5%CO2条件下90%DMEM培养基，10%胎牛血清(购自碧云天生物公司)培养细胞，收集指数生长期细胞，常规0.25%胰蛋白酶消化，计数，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤离心，试剂盒提取miRNA。检测方法同上。

1.4划痕愈合实验检测细胞迁移能力 将指数生长期的细胞，以1×105个/ml接种于6孔培养板中，脂质体包被miR-550a-5p与NC分别转染细胞(A549-miR-550a-5p组及A549-NC组)待细胞长满时，用枪头划痕，PBS冲洗2次后继续培养，分别在0 h与12 h测量细胞划痕愈合情况并拍照。以细胞划痕愈合百分比表示细胞运动能力(0 h的细胞划痕愈合为0%)。

1.5Transwell 检测细胞迁移能力 将指数生长期的A549-miR-550a-5p组及A549-NC组细胞常规消化，无血清培养基重悬，调整细胞浓度至5×105个/ml，上室加入细胞悬液200 μl，下室加入含10% FBS的DMEM 培养基900 μl，14 h后取出小室，干棉签拭去内表面细胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min，清洗，晾干，每组3个小室，每个小室选5个视野拍照并计数。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0软件进行数据分析，符合方差齐的正态分布采用非配对独立样本t检验；符合方差不齐的正态分布采用韦尔奇t检验；数据不符合正态分布运用曼-惠特尼轶和检验。应用GraphPad Prism8.0统计软件进行受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-550a-5p对肺癌及肺癌骨转移的诊断价值进行评估。

2 结 果

2.1肺原位癌与骨转移血清中miR-550a-5p的差异分析与验证 将GSE47056数据集中的表达矩阵导入GEO2R工具，分组后进行差异分析。差异分析结果显示，全部基因差异分析的火山图。见图1。其中，以miR-550a-5p为首的18个基因的表达量呈现显著上调，选择差异显著的miR-550a-5p进行差异表达验证及研究。

绿色代表下调差异基因，红色代表上调差异基因图1 肺癌高转移A549细胞株与低转移细胞株miRNA差异分析火山

2.2肺原位癌与骨转移血清miR-550a-5p与临床病理特征 肺原位癌患者外周血miR-550a-5p表达(0.157 2±0.021)高于正常人(0.140 3±0.011)，但差异无统计学意义(P>0.05)；肺癌骨转移患者(n=49)miR-550a-5p(0.201 9±0.015)显著高于原位癌(n=52,P<0.05)。miR-550a-5p与性别、吸烟史、肿瘤直径不相关，均无统计学意义(P>0.05)，与肿瘤病理分型相关(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床特性患者miR-550a-5p表达比较

2.3肺原位癌与骨转移血清中miR-550a-5p临床诊断骨转移价值分析 miR-550a-5p用于诊断肺癌骨转移患者，曲线下面积为0.684，95%置信区间为：(0.540～0.829)，灵敏度为76.19%，特异性为60.00%。见图2。

2.4miR-550a-5p促进A549迁移能力验证 与A549-NC组比较，A549-miR-550a-5p组划痕愈合率显著降低，穿膜细胞数显著增多(P<0.05,P<0.01)。见图3，表2、图4。

图2 血清miR-550a-5p诊断肺癌骨转移ROC曲线

图3 Transwell实验检测miR-550a-5p对A549细胞迁移能力影响(结晶紫染色，×100)

表2 两组划痕愈合率和穿膜细胞数比较

图4 划痕愈合实验检测miR-550a-5p对A549细胞迁移能力影响(×100)

3 讨 论

肺癌的治疗手段虽然日渐完善，但由于早期症状不明显，肺癌确诊时部分肿瘤已有区域转移扩展或远处转移。肺癌与前列腺癌、乳腺癌并称三大最易发骨转移癌症，会出现骨痛、病理性骨折、脊髓压迫等症状，严重影响患者生存率与生活质量。老年性肺癌在肺癌患者中比例较高，是否出现转移是选择治疗方案的重要考虑因素。目前诊断肺癌骨转移通常采用放射性核素骨扫描、发射型计算机断层扫描(ECT)、磁共振成像(MRI)等，但由于敏感度与特异度原因，难以实现骨转移早期诊断目的。骨组织活检是诊断骨转移的金标准，但由于身体状态等客观原因，有很多患者不会选择组织活检诊断。因此寻找肺癌骨转移的特异性生物标志物是目前研究热点。虽然诊断骨转移的特异性miRNA尚未有临床应用，但由于miRNA对肿瘤转化、良性和恶性肿瘤进展的特异性调节具有重要意义，并且miRNA存在于所有组织及血液中，在外周血中的miRNA由于有外泌体的包裹，其表达量稳定，不易降解，是具有广泛应用前景的生物标志物。

本文通过GEO数据库筛选发现miR-550a-5p在高转移能力与低转移能力肺癌之间表达差异明显。经体外实验验证，将miR-550a-5p转染到肺癌细胞株A549中观察其对细胞的影响，也发现高表达miR-550a-5p导致细胞迁移侵袭能力增强，具有促癌转移恶性生物学行为能力。Guo等〔8〕、Meng等〔9〕发现miR-550a-5p作为促癌因子在肺腺癌患者中高表达，与患者的生存率呈反比，在乳腺癌中也表现出相同趋势，说明其作用明确稳定，检测重复性好。Heilmeier等〔10〕发现在糖尿病病理骨折与绝经后骨质疏松性骨折的患者中miR-550a-5p表达明显升高，体外实验发现miR-550a-5p可以抑制成骨，说明miR-550a-5p在病理性骨折中发挥重要调节作用。

综上，miR-550a-5p既具有促肿瘤细胞迁移能力又具有抑制成骨反应能力，是肿瘤骨转移的潜在生物因子。如果可作为诊断肿瘤骨转移的分子标志物，将会为骨转移癌患者早期诊断提供极大方便。