陈 鹏 李嘉宁 刘 莉 崔 璇

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

心力衰竭常常由于心室泵送血液或充盈功能过低，心血排出量无法满足人体的新陈代谢要求，流向组织和脏器间的血液不足所致，是心脏的各种病变进展到严重阶段时的一种临床综合征[1-2]。随着人口增加、人口老龄化和各种并发症的增加，心力衰竭患者数量预计将在未来大幅上升[3]。研究发现，心力衰竭发生发展常常与心肌细胞代谢障碍、心肌重构密切相关[4]。西医治疗上结合中医辨证疗法可以有效改善心力衰竭患者的临床症状，提高生活质量[5]。参芪益心方是我院刘莉教授的经验方，具有理气、温阳、活血、利水之效，疗效较佳[6]。以往研究发现参芪益心方可以有效地改善心肌细胞的功能[7]。在本研究中，我们将参芪益心方用于阿霉素腹腔注射诱导的心力衰竭模型[8]，并追踪其对大鼠心功能和心肌细胞凋亡率的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 90只Wistar大鼠，雄性，购自长春市亿新实验动物公司，体质量（200±20）g，生产许可证：SCXK-（吉）2011-0004；使用许可证号：SYXK-（黑）2008-007。常温房间饲养，自由饮食、饮水。

1.2 药物与试剂 参芪益心方由太子参、黄芪各20 g，赤芍、茯苓、丹参、五味子、麦门冬、五加皮、葶苈子各15 g，桂枝、炙甘草各10 g组成。饮片由黑龙江中医药大学附属第一医院提供，加水浓煎后分别制成含量为1.696 g/mL和3.392 g/mL的水煎剂备用。卡维地洛（齐鲁制药有限公司，国药准字H20020535，规格6.25 mg/片），用灭菌注射用水配成0.558 mg/kg溶液备用。阿霉素（浙江海正药业，国药准字H44024359，规格10 mg/瓶），用灭菌注射用水配成0.8 mg/mL溶液备用。芪苈强心胶囊（石家庄以岭药业，国药准字Z20040141，规格0.3 g/粒），用灭菌注射用水配成0.3214 g/kg溶液备用。PBS缓冲液（杭州四季青生物生产，生产批号：020311）。

1.3 实验仪器 细胞凋亡检测试剂盒（美国罗氏公司），电热恒温箱（上海一恒），2135型轮转式组织切片机（德国莱卡公司），BX60光学显微镜（OLYMPUS，日本）病理图像分析系统（CIMAS Med 6.0，麦克奥迪图像技术有限公司）。

1.4 分组与造模 大鼠喂养1周后随机分为6组，每组15只，即正常对照组、模型组、西药对照组、芪苈强心组、参芪益心方低剂量组、参芪益心方高剂量组。参考文献[8]，除正常对照组外，其余各组于造模的第1、3、5周，用配制好的阿霉素溶液以3 mg/mL给药，第2、4、6周以2 mg/mL的剂量给药。正常对照组腹腔注射等容积的生理盐水。每周1次，共注射6周。

1.5 给药方法 造模成功后，正常对照组大鼠自由饮食、饮水，模型组大鼠注射10 mL/kg生理盐水，西药对照组注射0.558 mg/kg卡维地洛，芪苈强心组灌服0.3214 g/kg的芪苈强心胶囊混悬液，参芪益心方低剂量组灌服1.696 g/mL的参芪益心方煎剂，参芪益心方高剂量组灌服3.392 g/mL的参芪益心方煎剂，每日1次，共4周。

1.6 心功能检测 各组大鼠在灌胃结束后4周后进行超声心动图。腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位，胸部备皮，选用10 MHz射频探头，与胸骨呈20～30°，显示沿二尖瓣口至心尖方向的左心室长轴切面。B超获取胸骨旁左心室长轴的二维图形，在乳头肌水平将M型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得M超，用M超确定左心室舒张末期内径（LVDD）和收缩末期的内径（LVSD），并用Teichholtz公式计算射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）。每个数据集取连续3个心动周期的平均数。

1.7 标本采集与检测 1）心脏组织形态学。采用颈椎脱臼法处死大鼠，修块组织后清洗掉固定液，进行脱水、透明、浸蜡、包埋，常规切片后裱于涂有聚赖氨酸的载玻片上，4℃存放备用。切片经HE染色后用中性树胶胶印封片，光学显微镜下观察海马组织病理变化并摄片。2）细胞凋亡率检测。石蜡切片常规脱蜡至水，滴加胃蛋白酶K，室温下孵育30 min，PBS冲洗2次；擦干样品周围的水，滴加50 μL的Tunel反应混合液，在湿盒中37℃孵育60 min，PBS冲洗3次；擦干样品周围的水，滴加50 μL的转化剂POD，在湿盒中37℃孵育30 min，PBS冲洗3次；滴加显色剂DAB，室温下10 min，蒸馏水充分冲洗；苏木素复染1 min；常规脱水透明，中性树胶封片。用CMIAS对细胞凋亡切片进行分析，观察心肌细胞凋亡密度。在200倍显微镜下，每个切片随机选择5个视野并将图像输入计算机，选择1个细胞凋亡模块，用灰度对比调整方法计算视野内的染色细胞面积。然后把已凋亡细胞的总面积与统计领域的总面积之比（即表面密度）作为统计数字，取平均值进行数据分析。

1.8 统计学处理 应用SPSS26.0统计软件。计量资料以（）表示，计量资料和计数资料分别采用t检验和χ2检验，所有统计采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 见表1。与正常对照组比较，模型组大鼠的LVSD、LVDD均增加，FS、EF均有显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；各治疗组与模型组对比，各指标都有显著改善，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；参芪益心方低剂量组与西药对照组、芪苈强心组比较，各指标都有显著改善，差异有统计学意义（P＜0.01）。参芪益心方高剂量组与低剂量组比较，LVSD、LVDD无差异，FS、EF有改善，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与西药对照组比较，△△P＜0.01；与芪苈强心组比较，##P＜0.01；与参芪益心方低剂量组比较，▲P＜0.05。下同。

组别正常对照组模型组西药对照组芪苈强心组参芪益心方低剂量组参芪益心方高剂量组n 15 10 13 12 11 13 LVSD（mm）3.736±0.297**5.154±0.455 4.315±0.195**4.313±0.186**4.836±0.166*△△##4.328±0.159**LVDD（mm）5.102±0.236**6.731±0.333 5.917±0.182**5.798±0.156**6.319±0.256*△△##5.695±0.162**FS（%）48.279±1.990**22.229±2.097 41.530±2.481**41.620±2.313**28.020±2.506*△△##42.495±1.725**▲EF（%）83.741±2.372**44.701±3.740 76.530±3.191**74.919±3.290**52.502±4.671*△△##73.790±2.301**▲

2.2 各组大鼠心肌病理变化 正常对照组：心肌纤维成束排列，结构均匀，心肌间质无肿胀或充血，无炎细胞浸润。模型组：心肌纤维损伤、变性和坏死，间质血管扩张和充血，炎细胞浸润和心肌成纤维细胞增殖。西医对照组：心肌纤维轻微肿胀，少数纤维肿胀或破裂，间质血管扩张和充血，少量炎细胞发生浸润。芪苈强心组：心肌纤维肿胀，部分心肌组织萎缩，间质血管扩张充血，炎细胞浸润。参芪益心方低剂量组：心肌纤维充血和肿胀，有散在的炎细胞浸润。参芪益心方高剂量组：心肌纤维呈束状，轻微肿胀，有少量炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠心肌病理变化（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡情况 正常对照组：大脑偶见凋亡细胞。模型组：凋亡细胞数目比正常对照组明显增多。西医对照组：凋亡细胞数目比模型组明显减少。芪苈强心组：可见凋亡细胞，但数目比模型组减少。参芪益心方低剂量组：可见凋亡细胞，但数目比模型组减少。参芪益心方高剂量组：凋亡细胞数目比模型组明显减少。见图2。

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡观察（电镜，11 500倍）

模型组凋亡细胞的表面密度与正常对照组相比较大，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组调节细胞的表面密度明显降低（P＜0.01）。各治疗组之间比较无明显差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠细胞凋亡面密度（±s）

表2 各组大鼠细胞凋亡面密度（±s）

组 别n 面密度正常对照组模型组西药对照组芪苈强心组参芪益心方低剂量组参芪益心方高剂量组15 10 13 12 11 13 0.0668±0.0098**0.1130±0.0122 0.0777±0.0066**0.0809±0.0113**0.0813±0.0114**0.0740±0.0082**

3 讨论

研究表明，细胞凋亡是心血管疾病中介导的一种新的细胞死亡形式，多涉及几个关键分子，如RIPK1、RIPK3和MLKL[9]。心肌细胞在心力衰竭的早期出现与演变发展中起了关键性的作用，大量人体心肌细胞凋亡或（和）纤维化是心力衰竭时细胞功能异常的主要原因[10]。细胞凋亡引起心室重塑[11]，心室重塑与心肌细胞的超微结构变化密切相关。在心肌细胞中，心脏重构进行收缩运动时最基本的结构单元是肌丝，而肌丝超微构造的改变也会影响整体的收缩运动功能。线粒体是心肌细胞能量代谢的基础场所，其形态和结构变化在一定程度上反映了心功能的下降与否。成功建立心衰动物模型是研究心衰的重要一步。大鼠价格便宜，易于饲养，耐受性好，心脏的解剖学和生理学与人类相似。欧洲心脏病学会常依据心功能水平高低来评定心力衰竭的程度[12]；超声心动图可以准确评估心腔的大小和心室功能，逐渐应用于心血管疾病的小动物模型研究[13]。故本研究主要通过B超评估心力衰竭大鼠的心功能，并通过公式来估算EF和FS。

中医首次提到“心衰”一词源于《黄帝内经》“心气始衰，苦忧悲……故好卧”。通过历代不同专家的探讨，心衰原因大多归于本虚标实，本是心脏缺少阳气，标是血液瘀滞、水液和痰水潴留[14]。气为血之帅，故气既可生血，也能行血，因心气不足故血瘀脉道；气虚之极为阳虚，长期气虚会导致阳气不足，血液失于温煦，亦可滞于脉中。气既可生津，又可行津，气虚则无法运化水液，气不行水，从而导致水液与痰液停滞。

我院刘莉教授在理气、温阳、活血、利水基础上研究出参芪益心方[7]。笔者以参芪益心方加味，取其大补心阳且活血化痰之功，基本组成包括太子参、黄芪、桂枝、茯苓、赤芍、丹参、五味子、麦门冬、五加皮、葶苈子、炙甘草。方中君药为太子参与黄芪，补中益气，振奋心阳，令瘀血、水饮之邪去；《本草纲目》“丹参……能破宿血也”，丹参、赤芍合用祛瘀通络利水；五加皮利水胜湿消肿；五味子益气生津；葶苈子利水平喘。诸药合用使心阳得温，阳气得充，瘀血得行，经脉得通，诸症得解。

现代临床研究发现参芪益心方在治疗心力衰竭疗效显著。药理研究结果表明太子参可以改善心肌组织的氧化应激，改善NOS-NO系统，减少心肌细胞的凋亡[15]。黄芪的药理作用与它对细胞内信号的影响有关，通过减少信号通路的激活来减弱细胞凋亡，并恢复左心室的收缩和舒张功能[16]。茯苓可以明显减低炎症因子的表达水平，如hs-CRP、TNF-α和IL-6，故可抑制炎症反应，抵抗神经内分泌系统的过度兴奋，进一步逆转了心室重构，黄芪和茯苓的组合可以修复心肌损伤[17]。经吴繁等[18]研究发现，参芪益心方可以有效抑制心肌细胞凋亡，逆转衰竭心肌能量底物的代谢重构，保护心肌细胞。

本研究结果证明参芪益心方可以有效改善心衰大鼠心脏功能、病理变化和细胞凋亡率，为进一步研究和开发抗心衰的有效药物奠定实验基础。