吴 博，李明瑕，刘姝瑞，刘忠思，黄朝波，陈历水✉

（漯河市卫龙生物技术有限公司，漯河市食品安全与营养健康重点实验室，河南 漯河 462000）

魔芋学名Amorphophallus rerieri，为单子叶植物纲，天南星科耐荫性多年生草本植物的块茎[1]。鲜魔芋块茎经过干燥、机械粉碎、风选等工序得到魔芋飞粉、魔芋精粉、魔芋全粉等产物。这些魔芋粉样品中同时含有葡甘露聚糖（Konjac glucomannan，KGM）和淀粉两种大分子物质[2]。其中，葡甘露聚糖由D-葡萄糖和 D-甘露糖通过β-1,4糖苷键聚合而成[3]。它具有多种独特的理化性质，如流变性、增稠性、胶凝性和成膜性，同时对人体有降低胆固醇、改善血糖、促进肠道活性和免疫功能的作用[1,4-7]。魔芋淀粉是魔芋第二大营养成分，仅次于KGM，魔芋淀粉也被证明具有调节消化速率，降低糖尿病患者的血糖反应和胰岛素抵抗等功效[1]。

目前，魔芋粉中葡甘露聚糖和淀粉含量的检测方法通常采用GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》和NYT 494—2010《魔芋粉》描述的方法进行。但是这两种方法在同时含有葡甘露聚糖和淀粉的魔芋粉样品的测定中互相干扰，导致测定值均远高于实际值，不能很好地对魔芋粉样品进行评价[8-10]。DB 43/T 477—2009《魔芋食品中葡甘聚糖的测定 气相色谱法》采用气相色谱法对魔芋精粉中葡甘聚糖含量进行测定，但气相色谱的衍生过程操作较为繁琐并且可能产生衍生异构体[11]，同时该方法没有对魔芋粉中淀粉含量进行分析。

近些年来，柱前衍生化高效液相色谱多被用于多糖物质中单糖组成的测定以及魔芋粉中葡甘聚糖含量的检测[12-16]。本研究使用柱前衍生高效液相色谱法对四种魔芋粉（魔芋精粉、魔芋飞粉、葡甘露聚糖样品、魔芋全粉）中葡甘露聚糖和淀粉含量进行分析检测，同时与上述两种国家标准方法的测定值进行比较。该实验结果表明柱前衍生高效液相色谱法能够对四种不同葡甘聚糖和淀粉占比的魔芋粉样品进行测定，且该方法回收率高、重复性好，为魔芋粉的质量控制提供理论基础和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

魔芋精粉（样品1）、魔芋飞粉（样品2）、葡甘露聚糖样品（样品3）、魔芋全粉（样品4）：楚雄德源魔芋生物科技有限公司；D-甘露糖（纯度99%）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮：上海麦克林生化科技有限公司；D-葡萄糖（纯度99.5%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；氢氧化钠、盐酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱LC-16L：日本岛津公司；十万分之一分析天平：梅特勒公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品中水分、蛋白、灰分、单糖含量的测定

水分测定方法参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中描述的方法进行。蛋白测定方法参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中描述的方法进行。灰分测定方法参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中描述的方法进行。

单糖含量测定：称取2.0 g左右魔芋粉样品，用100 mL乙醇（85%，体积比）数次洗涤，收集洗涤后的乙醇溶液，水浴蒸干乙醇后，于105 ℃烘箱烘干至恒重，放入干燥器内冷却0.5 h后称重。

同时以GB 5009.9—2016 《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》测定淀粉和NYT 494—2010《魔芋粉》中描述的方法测定葡甘露聚糖含量。

1.3.2 样品前处理

样品前处理方法参照GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》中第二法，稍作修改。

除单糖：称取2.5 g左右魔芋粉样品（精确到0.001 g），置于放有慢速滤纸的漏斗中，用150 mL乙醇（85%，体积比）分数次洗涤残渣，以充分除去可溶性糖类物质。

酸解：滤干乙醇溶液。以100 mL水洗涤漏斗中残渣并转移至250 mL锥形瓶中，加入30 mL盐酸（1+1），接好冷凝管，置沸水浴中回流2 h。回流完毕后，立即冷却。

除蛋白、定容：待试样水解液冷却后，以氢氧化钠溶液（400 g/L）调节样品pH约为7。然后加20 mL乙酸铅溶液（200 g/L），摇匀，放置10 min。再加20 mL硫酸钠溶液（100 g/L），以除去过多的铅。摇匀后将全部溶液及残渣转入500 mL容量瓶中，用水洗涤锥形瓶，洗液合并入容量瓶中，加水稀释至刻度。过滤，弃去初滤液20 mL，滤液稀释4倍供测定用。

1.3.3 衍生化方法

衍生化方法参照周彦强等[12]描述的方法进行，稍作修改。取1 mL样品，加入0.65 mL 0.1 moL/L氢氧化钠、0.75 mL PMP的甲醇溶液（0.1 g/mL），70 ℃水浴30 min，反应后加入0.65 mL 0.1 moL/L HCL。使用2 mL氯仿洗涤6次。取0.5 mL上清，加入1 mL水，通过0.45 μm水系滤膜过滤，装入液相小瓶。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：XBridge C18（4.6×150 mm, 5 μm）；流动相：乙腈：0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）=18∶72；柱温30 ℃；检测波长245 nm，流速0.5 mL/min，进样量10 μL，检测时间30 min。

1.3.5 KGM中葡甘露聚糖和淀粉含量的计算方法

标准曲线的制作将混合标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线得到待测液中葡萄糖和甘露糖的质量浓度。

试样中葡甘露聚糖的含量按式（1）计算，淀粉的含量按式（2）计算：

式中：x1：试样中的葡甘露聚糖含量（g/100 g）；x2：试样中的淀粉含量（g/100 g）；ρ1：试样液中甘露糖的质量浓度（mg/mL）；ρ2：试样液中葡萄糖的质量浓度（mg/mL）；m：称样量（g）；n：样品稀释倍数；1.562：KGM分子中葡甘露聚糖与甘露糖的质量比；0.9：魔芋葡甘露聚糖/淀粉相对分子质量与单糖相对分子质量之比；100：换算系数；计算结果保留三位有效数字。

1.3.6 方法学考察

精密度：分别称取魔芋精粉、魔芋飞粉、市售葡甘露聚糖样品、魔芋全粉2.5 g各6份，经酸解前处理和衍生处理后用高效液相色谱仪分别进行6组基质样品独立测试甘露糖和葡萄糖含量，并通过公式计算为葡甘聚糖和淀粉含量，通过计算样品6组测定值的相对标准偏差评价方法的精密度。

回收率：分别称取魔芋精粉、魔芋飞粉、市售葡甘露聚糖样品、魔芋全粉各2.5 g，经酸解前处理后进行相应的加标回收实验，加标后进行衍生并通过高效液相色谱进行测定，每组3个平行。不同样品的中浓度和高浓度加标量如表1所示。

回收率按公式（3）计算：

在现今高速发展的信息时代，传统官僚体制已经不能适应现代社会的变革，管理型政府向服务型政府转变的过程中需要基层政府能够做出更快的反应、付出更低廉的成本并提供更优质的服务，而作为五大资源之一的人力资源的有效开发与精准运用也就变得尤为重要。

式中：R：回收率；C1：加标后测定浓度（g/L）；C2：加标之前测定浓度（g/L）；C3：加标目标的理论浓度（g/L）。

1.4 数据分析

所有实验数据均以3个以上独立实验的平均值和标准差表示。使用SPSS 20.0软件（IBM，Chicago，IL，USA）进行显著性分析，P＜0.05表示具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 样品中水分、蛋白、灰分、单糖含量

魔芋粉中除葡甘聚糖和淀粉外，还包含蛋白、灰分、单糖、灰分等成分。对四种魔芋粉样品中蛋白、灰分、单糖、灰分进行测定，能够更全面的了解不同魔芋粉的组成，测定结果如表2所示。

表2 魔芋粉样品中水分、灰分、蛋白、单糖含量Table 2 Moisture, ash, protein and monosaccharide contents in konjac flour samples %

2.2 样品中葡甘聚糖和淀粉含量

在该部分实验中，分别采用有国标NY/T 494—2010和GB 5009.9—2016第二法以及柱前衍生高效液相色谱法对魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量进行检测。同时结合魔芋粉中其它理化指标对测定值进行评价，以选择适于魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量的测定方法。

2.2.1 柱前衍生高效液相色谱法测定样品中葡甘聚糖和淀粉含量

2.2.1.1 标准曲线的绘制 配置不同浓度的甘露糖和葡萄糖混合溶液，依照1.3中描述的方法对标准品进行衍生和检测，标准样品中甘露糖和葡萄糖测定的高效液相色谱图如图1所示。可知，甘露糖和葡萄糖出峰时间分别为12.883、24.932 min。两种成分在35 min内达到完全分离，分离度高，峰型好。

图1 混合标准样品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard sample

表3 标准曲线线性参数Table 3 Linear parameters of standard curves

表4 高效液相色谱法测定样品中葡甘聚糖和淀粉含量Table 4 Determination of KGM and starch in samples by HPLC %

以标准样品浓度为横坐标，峰面积/105为纵坐标绘制标准曲线，线性关系如表3所示。甘露糖和葡萄糖在0.05～1.5 g/L的检测范围内，线性相关系数均大于0.99，线性关系好，可用于单糖样品的检测。

2.2.2 标准方法测定样品中葡甘聚糖和淀粉含量

分别使用GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》和NYT 494—2010《魔芋粉》中描述的方法测定四种魔芋粉样品中KGM和淀粉含量，测定结果如表5所示。

表5 标准方法测定样品中葡甘聚糖和淀粉含量Table 5 Determination of KGM and starch in samples by standard method %

2.2.3 测定结果分析

根据NY/T 494—2010和GB 5009.9—2016第二法对样品中葡甘聚糖和淀粉含量进行测定，将测定结果与水分、灰分、蛋白、单糖含量进行累加，其中魔芋精粉总量达185.90%、楚雄德源魔芋飞粉总量达110.00%、葡甘聚糖样品总量达177.97%、魔芋全粉总量达150.87%，显然是不合理的。

柱前衍生高效液相色谱法对样品中葡甘聚糖和淀粉含量进行测定，楚雄德源魔芋精粉总量达97.92%、楚雄德源魔芋飞粉总量达93.25%、襄樊惠葡葡甘露聚糖总量达96.64%、魔芋全粉总量达99.53%，表明该方法能够很好地用于魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量的检测。

2.3 方法学考察

2.3.1 方法重复性验证

根据上述实验，完全酸水解结合柱前衍生化的方法能够很好的用于魔芋粉组成的测定，对该方法测定样品的重复性进行验证。4种魔芋粉检测方法重复性的测定结果如表6所示。

表6 方法重复性验证（n=6）Table 6 Method repeatability validation (n=6) %

4种魔芋粉样品中葡甘露聚糖和淀粉6组平行的测定值RSD≤4.40%，表明该方法重复性好，能够用于魔芋粉中葡甘露聚糖和淀粉含量的测定。

2.3.2 方法回收率验证

葡甘聚糖为大分子混合物，市面上没有标准品售卖。故在该实验中仅测定柱前衍生部分的回收率。回收率包括加入的甘露糖和葡萄糖标准品的回收率以及折算回葡甘露聚糖和淀粉的回收率。4种魔芋粉检测方法回收率的测定结果如表7所示。

表7 方法回收率验证Table 7 Method recovery validation %

4种魔芋粉样品中甘露糖加标回收率在87.98%～103.31%之间，RSD≤5.25%；葡萄糖加标回收率在92.94%～107.57%之间，RSD≤3.25%；折算回葡甘露聚糖回收率在87.98%～103.31%之间，RSD≤5.25%；淀粉回收率在91.50%～108.05%之间，RSD≤7.67%。回收率测定结果表明该方法回收率高，平行性好。

3 结论

本研究建立了同时检测4种魔芋粉（魔芋精粉、魔芋飞粉、葡甘露聚糖样品、魔芋全粉）中葡甘露聚糖和淀粉含量的高效液相色谱方法。魔芋精粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分别为62.69%和15.92%；魔芋飞粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分别为13.73%和42.16%；葡甘露聚糖样品中葡甘聚糖和淀粉含量分别71.23%和16.38%；魔芋全粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分别为43.32%和24.04%。该方法同时测定4种魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量6组重复样品间RSD≤4.40%，加标回收率在87.98%～108.05%之间，RSD≤7.67。本方法可满足魔芋粉样品中葡甘聚糖和淀粉含量的同时测定，为魔芋粉样品的分级提供可行的评价方法。