王琦，蒙丽丹，田润，王淑培，谢彩锋,3，杭方学,3，李凯,3*

（1.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530004）

（2.南宁师范大学环境与生命科学学院，广西南宁 530001）

（3.糖业及综合利用教育部工程研究中心，广西制糖协会，广西南宁 530004）

甘蔗是许多国家重要的农业作物之一，目前主要用于蔗糖、燃料酒精生产[1,2]。事实上，甘蔗除了含有蔗糖与还原糖，还含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸、必需微量元素、维生素等营养物质以及有机酸、多酚等活性物质，且口感清甜爽口，深受消费者喜爱，应用于饮料行业具有巨大的市场潜力。目前市场上甘蔗基饮料种类繁多，主要为甘蔗原汁、甘蔗原汁复配饮料及甘蔗浓缩汁加工的饮料等[3]。

然而，甘蔗基饮料在贮藏和商品流通过程易产生后混浊现象，影响了其饮料开发的感官价值。目前普遍认为饮料产生后混浊主要原因是蛋白质和多酚发生相互作用，形成肉眼可见的聚集物[4-7]，虽然不影响饮料的食用安全，但会影响消费者的接受度，进而不利于其市场的开拓。因此研究甘蔗原汁后混浊主要成分及后混浊作用机制对有效控制其后混浊问题是至关重要的[8-10]。近些年，大量研究发现蛋白质是导致饮料发生后混浊的重要原因，当蛋白质浓度达到3～4 mg/L时，饮料就容易产生混浊或沉淀[11,12]。Zeng 等[13]研究储藏过程荔枝汁成分变化，发现蛋白质和酚类含量在上清液中下降最为明显，在后混浊物则呈上升趋势；Millet 等[9]发现苹果基饮料混浊物的蛋白质含量占混浊物的18%～24%。目前关于饮料后混浊的研究主要集中在葡萄酒、苹果汁、啤酒、荔枝汁和茶等饮料[14-18]，而这些饮料在成分、含量及性质上，与甘蔗原汁存在明显差异，特别是在蛋白质、多酚、多糖等易导致后混浊物质的含量、结构与性质上，因此其在贮存或流通过程发生的后混浊作用与其他饮料体系的可能不完全一样。目前对于甘蔗原汁后混浊问题的研究，除了本研究团队前期分析了甘蔗浓缩汁中的后混浊物主要成分外[2]，尚未见有任何报道。因此本试验在分析甘蔗原汁后混浊主要成分基础上，重点分析其蛋白质的组分及二级结构，以鉴别出易发生后混浊的蛋白质种类及结构特性，为解决甘蔗原汁后混浊问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蔗，广西扶绥市甘蔗双高基地提供，经小型压榨机榨汁后用有50 nm 孔径的陶瓷膜过滤处理，获得甘蔗清汁，置于-18 ℃冷库中保存备用。

硫酸铵、盐酸、硫酸、氢氧化钠、硫酸钾、硫酸铜、甲醇和冰醋酸，成都市科龙化学品有限公司；SDS-PAGE 变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒、透析袋（3500 ku）和甘氨酸，索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YY-T1-10L 超纯水仪，成都优越科技有限公司；TLE-204E 分析天平，梅特勒-托利多中国有限公司；A-5082 Grodig 连续波长多功能微孔检测器，奥地利Untersbergstr.1A 公司；Mini-Protein3Cell 蛋白质电泳系统，美国Bio-Rad 公司；Orbitrap Elite 组合式质谱，美国Thermo Fisher Scientific 公司；KjelMaster K-375凯氏定氮仪，德国Bruker 公司；IRTracer-100 傅立叶红外光谱，日本岛津公司；Gel Doc2000 凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；CenLee18R 台式高速冷冻离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；L-8900 氨基酸分析仪，日本日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甘蔗原汁后混浊物的收集

甘蔗汁置于-18 ℃储藏6 个月，常温解冻后经8000 r/min 离心15 min，分离上清液和沉淀，超纯水水洗沉淀，去除可溶性物质，冷冻干燥48 h，获得冻干粉末[9]，-18 ℃储存备用。

1.3.2 后混浊物主要成分的测定

1.3.2.1 总糖的测定

称量20 mg 沉淀物，用2 mol/L 的三氟乙酸水解沉淀中的糖，采用蒽酮硫酸法测总糖[19]。

1.3.2.2 总酚的测定沉淀中总酚的提取参考Mane 等[20]方法并作出一些修改。将2 mL 0.05%（V/V）三氟乙酸酸化的丙酮/水/甲醇混合溶液（51:34:15，V/V/V）加入到10 mg混浊物中，超声提取（350 W，90 min）后，离心，取上清液。采用Folin-Ciocalteu 法测定混浊物的总酚含量。

1.3.2.3 蛋白质含量的测定

蛋白质含量采用凯氏定氮法测定[21]。

1.3.2.4 灰分的测定

灰分测定采用灼烧法[22]。

1.3.3 甘蔗原汁上清液蛋白质的收集

采用盐析法收集甘蔗汁上清液中的蛋白质[23]。具体操作为：在上清液中加入硫酸铵至80%饱和度，磁力搅拌至硫酸铵完全溶解，于4 ℃静置3 h，离心分离（8000 r/min，4 ℃，15 min），收集沉淀，并将其置于超纯水中透析48 h 去除盐类及小分子杂质，期间每12 h 更换一次水。将透析袋中样品冻干，并置于-20℃储存备用。

1.3.4 SDS-PAGE 凝胶电泳分析

SDS-PAGE 参考Lin 等[24]的方法并作出一些修改。将10 mg 上清液蛋白质和后混浊蛋白质复溶在8 mol/L 尿素中，在涡旋振荡器上混匀，取上清20 μL与等量的上样缓冲液混合均匀，煮沸5 min 后，离心，取上清液上样。

电泳条件如下：浓缩胶和分离胶的浓度分别为5%和15%，上样量30 μL，浓缩胶电压80 V，持续30 min；分离胶电压120 V 至当样品条带迁移至凝胶底部时电泳结束。使用0.125%的考马斯亮蓝R250 溶液（甲醇:冰醋酸:水=3:1:6）对胶进行染色，随后用脱色液将胶的背景脱至无色，并使用凝胶成像系统拍照。

1.3.5 酶解及质谱鉴定

将电泳条带均匀切成小份,胶内酶解参照Shevchenko[25]的方法。将胶条颗粒漂洗、褪色、脱水及还原烷基化处理后，按1:50 比例用胰蛋白酶酶解过夜，最后用LTQ Orbitrap Elite 组合式质谱对酶解的肽段进行分析。得到的质谱图用Proteome Discoverer 1.3软件通过SEQUEST 算法比对Uniprot 数据库进行蛋白质搜索。

1.3.6 甘蔗原汁后混浊物蛋白质氨基酸组成分析

采用氨基酸分析仪分析蛋白质的氨基酸组成[26,27]。具体操作为：取30 mg 蛋白样品于具塞水解管内，添加10 mL 6 mol/L HCl 置于110 ℃烘箱水解22 h，期间间断性摇匀水解液，使样品充分水解。水解完毕后冷却过滤，取1 mL 滤液于60 ℃水浴蒸干，复蒸一次后，用0.02 mol/L HCl 冲洗蒸干物并定容至10 mL，过膜，氨基酸分析仪分析。

1.3.7 蛋白质平均疏水性分析

甘蔗原汁上清液蛋白质和后混浊蛋白质的平均疏水性经验计算公式如下[28]：

式中：

Xi——氨基酸占样品中所有氨基酸的摩尔比例；

Hφi——氨基酸的疏水值。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）的测定

按照参考文献[29,30]的方法对冷冻干燥后的蛋白质进行FT-IR 测定。

1.4 数据处理

运用SPSS 23.0 软件对数据进行单因素方差分析（p＜0.05），利用Origin 2017 软件作图。

2 结果与讨论

2.1 后混浊物主要成分的分析

甘蔗原汁后混浊物的主要成分如图1 所示，包括蛋白质、总糖、总酚和灰分等，表明蛋白质、总糖、总酚和灰分都参与了甘蔗原汁后混浊过程。后混浊物中，总糖含量最高，达60.94%；其次是灰分和蛋白质，分别为19.52%和18.43%；总酚含量最少，仅为0.62%。甘蔗原汁后混浊物中总糖含量最高，这可能是由于甘蔗原汁中可溶性糖含量高，在后混浊过程会有少量被包裹或夹带在后混浊物中[6]。Belleau 等[31]在研究啤酒混浊物中也发现高含量的碳水化合物，认为它们通过某种方式凝结或粘附在蛋白质-多酚主链上而被包裹在后混浊物中的，并不是导致后混浊形成的主要因子，蛋白质才是导致饮料混浊的重要因素[32-34]。在饮料中，蛋白质能与多酚、多糖、咖啡碱及Ca2+等多种成分发生相互作用，逐渐聚集形成混浊[35]。

2.2 后混浊蛋白质的分子质量分布

甘蔗原汁后混浊蛋白质和上清液蛋白质的SDS-PAGE 分析见图2。甘蔗原汁上清液蛋白质主要分子质量在20 ku，而相应后混浊蛋白质分子质量广泛分布在42 ku 左右和20 ku 以下。这可能是由于该分子质量范围的蛋白质容易参与后混浊，也可能是由小分子质量的蛋白质聚集形成复杂的蛋白质聚集体。许多针对果汁和葡萄酒的研究发现，后混浊物中蛋白质的分子质量集中在一定的范围内，它们具有一定的相似性。大麦麦芽汁中混浊蛋白质分子质量主要集中在25～45 ku 及18.4 ku 两部分[36]；葡萄酒后混浊蛋白质则主要分布在18～26 ku 及41、53 和69 ku 处[11]。无论上清蛋白质还是后混浊蛋白质分子质量均小于100 ku，这可能与甘蔗汁经50 nm 陶瓷膜处理有关，大分子蛋白质被截留。

2.3 质谱鉴定

为了鉴定后混浊蛋白质的种类，对图2 的条带a和b 进行质谱鉴定，结果如表1 所示。条带a 和b 分别鉴定出44 种和12 种蛋白质，表明甘蔗原汁后混浊蛋白质种类繁多。这些蛋白质的理论等电点大都位于4～6 之间，与甘蔗原汁的初始pH 5.5 左右接近，因此等电点蛋白质析出可能导致蛋白质参与后混浊。其中条带a 丰度较高的几种蛋白质为PREDICTED：

表1 后混浊物蛋白质谱鉴定Table 1 Identified haze proteins by LTQ-Orbitrap

续表1

calmodulin-7 isoform X1、protein Z、PREDICTED：calcium-dependent protein kinase 34 isoform X1，其理论分子量大部分位于15～25 ku 处，与电泳结果一致，而条带b 丰度较高的蛋白质为protein Z 和hypothetical protein SORBIDRAFT_01g014740，其理论分子量大都位于9～25 ku，明显小于电泳结果，这进一步证实了上述条带b 处的蛋白质一部分是由小分子蛋白质聚集，最终蛋白质呈多聚体形式存在导致其分子质量变大。甘蔗原汁后混浊蛋白质中鉴定出大量的protein Z。这与Li 等[37]研究啤酒酿造过程后混浊物的主要成分是protein Z 的结论是一致的。

2.4 氨基酸分析结果

由表2 可知，上清液蛋白质和后混浊蛋白质的氨基酸含量分别占样品干重的19.82%和11.82%，这与凯氏定氮法测定的相应蛋白质含量为29.49%和18.43%有一定的差距，说明其中存在一定量的无机氮。

表2 上清液蛋白质和混浊物蛋白质的氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of supernatant protein and haze protein

按照氨基酸比例计算，上清液蛋白质和后混浊蛋白质的氨基酸组成结果显示，无论上清液蛋白质还是后混浊蛋白质，谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和异亮氨酸含量均较高，说明它们是甘蔗原汁蛋白质的主要氨基酸。不同饮料体系中，后混浊蛋白质的氨基酸组成各有不同，谷氨酸是苹果汁后混浊蛋白质中的第一或第二组成氨基酸[9]，而在啤酒混浊物中则发现了高含量的脯氨酸[36]。在蛋白质水解过程中，谷氨酰胺和天冬酰胺分别转化为谷氨酸和天冬氨酸，因此他们的含量往往被高估[9]。脯氨酸和半胱氨酸均是疏水性较强的氨基酸，其在后混浊蛋白质中的含量分别为上清液蛋白1.44 和1.95 倍。研究表明肽键与脯氨酸具有空间位阻，这些蛋白质不能自由旋转形成有序螺旋，从而使蛋白质高级结构变得松散无序，疏水位点暴露，易与多酚相互作用形成沉淀[38]。而半胱氨酸含有二硫键，贮藏会导致蛋白质去折叠，使隐藏于分子内部的巯基、二硫键和疏水基团暴露，蛋白质间的相互作用增强[39]。上清液蛋白质和后混浊蛋白质中疏水性氨基酸的比例分别为55.46%和57.13%。根据Lozano 等[28]经验公式计算后混浊蛋白质的平均疏水值分别为0.87，比上清液蛋白质的平均疏水值高3%。这与黄酒后混浊蛋白质的疏水值比上清液蛋白质高16.46%有所不同[40]，可能是由于原料不同，后混浊蛋白质的性质有所不同。上述结果表明甘蔗原汁后混浊蛋白质和上清液蛋白质氨基酸的种类和含量差异不明显，蛋白质的低疏水值不是导致甘蔗原汁后混浊的主要因素。

2.5 甘蔗原汁后混浊蛋白质二级结构分析

FT-IR 能够有效分析食品成分的化学组成和构象结构，是监测蛋白质二级结构变化的有效工具。常见的二级结构有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等。

由图3 可以看出，在波段500～1000 cm-1，上清液蛋白质的吸光度明显大于后混浊蛋白质，而在酰胺I带（1600～1700 cm-1）处，却表现出相反的结果，相对于上清液蛋白质，后混浊蛋白质的吸光度偏向于高波段，说明后混浊蛋白质和上清液蛋白质的结构存在差异。

图3b 为上清液蛋白质和后混浊蛋白质在酰胺I带的二阶导数图谱，二阶导数图谱显示上清液蛋白质具有5 个明显的峰，而后混浊蛋白质则具有7 个峰。对酰胺I 带原始谱图（图3a）分峰拟合，各峰所对应的结构如表3 所示。

表3 傅立叶红外光谱拟合图谱分析Table 3 Fitting analysis of FT-IR spectra

由表4 可知，后混浊蛋白质和上清液蛋白质的二级结构组成存在显著的差异，其中后混浊蛋白质中无规卷曲的含量为21.66%，而上清液蛋白质则不含无规卷曲结构，后混浊蛋白质的α-螺旋和β-转角含量分别比上清液蛋白质低33.43%和22.42%，β-折叠含量差异不大。研究表明蛋白质二级结构和疏水性存在相关性，其疏水性与α-螺旋的含量成负相关，与β-折叠和无规卷曲含量呈正相关[41]。甘蔗汁后混浊蛋白质具有高含量的无规卷曲和低含量的α-螺旋结构，其疏水性更强，蛋白质之间以及蛋白质与酚类等其他组分相互作用，溶解度降低，从而促进甘蔗汁后混浊。此外，陶瓷膜过滤甘蔗汁时，为了加快过滤速度，往往加热至90 ℃以增加通量，高温条件可能破坏了甘蔗汁蛋白质的空间结构，疏水性残基暴露，从而导致蛋白质疏水性增强，加速混浊和沉淀形成。

表4 甘蔗原汁后混浊蛋白质和上清液蛋白质二级结构含量Table 4 Secondary structure of protein composition in the haze protein and the supernatant protein

3 结论

以甘蔗原汁上清液蛋白质为对照，对比分析甘蔗原汁后混浊物及其后混浊蛋白质的特性，结果表明：

（1）甘蔗原汁形成沉淀的过程是复杂的，其后混浊物中主要由蛋白质、总糖、总酚和灰分组成。

（2）甘蔗原汁后混浊蛋白质分子量主要分布在42 ku 左右和20 ku 以下，分别鉴定出12 种和44 种蛋白质，其中丰度较高的几种蛋白质为protein Z，PREDICTED：calmodulin-7 isoform X1，PREDICTED：calcium-dependent protein kinase 34 isoformX1 和hypothetical protein SORBIDRAFT_01g014740。

（3）后混浊蛋白质氨基酸的平均疏水值略高于上清液蛋白质，表明氨基酸组成的差异不是导致甘蔗汁后混浊的主要原因。两者的二级结构差异明显，后混浊蛋白质中具有高含量的无规卷曲和低含量的α-螺旋、β-转角结构。

综上，分子质量大小低于42 ku、疏水值高、α-螺旋含量低和无规卷曲含量高的蛋白质更容易参与甘蔗原汁后混浊。