刘明超，王荣平，何宇星，杨晓凤，于靖和，乌云达来

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018）

酸马奶是一种产于中亚和东欧地区的发酵马奶饮料，在蒙古语中酸马奶被称为“策格”[1,2]，又叫马奶酒，它是以鲜马乳为原料，利用天然发酵剂和传统发酵技术发酵而成[3]。其风味独特，醇香浓郁，营养价值很高，具有驱寒、活血、舒筋、消食、健胃等功能[1]。酸马奶中的有益微生物主要由乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）和酵母菌（Yeast）组成[4,5]，在酸马奶中发现了各种乳酸菌菌株，包括干酪乳杆菌、植物乳植杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌等[6,7]。乳酸菌作为一大类益生菌，具有免疫调节、抑制胃肠道病原菌等多种生物活性，其所产的胞外多糖因来源安全、类型多样、性能优异等特点受到人们的广泛关注[8,9]。酸马奶的诸多医用价值主要取决于其中所含有的益生菌及其代谢产物（如抗生素、细菌素、胞外多糖等）以及马奶降解产物（如多肽、有机酸等）等。

胞外多糖（Exopolysaccharides，EPSs）是由一些微生物（细菌、真菌、放线菌、蓝藻等）在代谢过程中分泌的一类具有不同糖残基的高分子聚合物，一般由单糖通过糖苷键以直链或支链形式连接而成[10]，其功能多样，质量稳定，受自然地理和气候环境的影响小，具有较高的性价比和广阔的应用前景[11,12]。由于胞外多糖具有独特的物理和流变性能，即成胶、增稠、乳化及絮凝剂等，使其在食品、化妆品、胶粘剂、废水处理、油回收以及药理学行业方面得到了广泛应用[13-15]。此外，胞外多糖对于改善机体肠道微生态、抗肿瘤[16]、免疫调节[4]、降低血液胆固醇[17,18]等都有所裨益。基于乳酸菌胞外多糖的一系列生理生化特点，本研究将对从内蒙古酸马奶中分离纯化的一株产胞外多糖植物乳植杆菌NM18 进行相关胞外多糖结构的研究，完善关于产胞外多糖酸马奶源乳酸菌的特异性筛选和鉴定，对于后续实现植物乳植杆菌胞外多糖的工业化应用及其在机体内的益生作用提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和主要试剂

1.1.1 菌株来源

菌株分离自内蒙古酸马奶样品中一株产胞外多糖的植物乳植杆菌Lpb.plantarumNM18[19]。

1.1.2 主要试剂

Cellulose DE-52，Whatman 公司；Sepharose CL-6B，Pharmad 公司；截流膜，Solarbio 公司；葡聚糖系列标准品，美国Sigma 公司；TSK-GEL GM PWXL 柱，Tosoh Corp 公司；Agilent 7890B GC system-5977A MSD，Palo Alto 公司；HP-5 毛细管柱，CA 公司；Bruker AVANCE AV-500 型，Fällanden 公司。

1.2 菌株活化

将甘油保藏的菌株NM18 接种于脱脂乳培养基中，37 ℃恒温活化。

1.3 胞外多糖的分离纯化

分离胞外多糖按照Zhu 等[20]的方法，稍作修改。待脱脂乳培养基凝固后（12 h）用接种环接于MRS 液体培养基中，37 ℃恒温传2 代培养，每代12～24 h，离心除去菌体和凝结蛋白等杂质。取上清液，加入80%（m/V）三氯乙酸（TCA）使其最终浓度为4%（m/V），4 ℃静置放置12 h，离心（10000×g，20 min，4 ℃）去除蛋白沉淀，50 ℃旋转蒸发浓缩上清液，用80%（V/V）乙醇在4 ℃下沉淀多糖24 h。离心（12000×g，30 min，4 ℃）收集多糖沉淀；用去离子水中透析48 h 并冻干得到粗多糖（CEPS）。

对CEPS 采用DEAE-Cellulose 52（2.6×30 cm）离子交换色谱分级纯化。称取CEPS 于去离子水中充分溶解后使用0.45 μm 滤膜过滤，然后上样于DEAE-Cellulose 52 离子交换层析柱中，依次用不同浓度NaCl 溶液（0、0.1、0.3、0.5 和0.7 mol/L）梯度洗脱，流速为1 mL/min，收集（10 min/管）后用苯酚-硫酸法检测各管的多糖含量[21]。收集、浓缩、透析和冻干后用Sepharose CL-6B 凝胶柱（1.6×40 cm）进一步纯化，用去离子水以0.5 mL/min的流速洗脱。收集（10 min/管），透析后冻干。

1.4 纯度和分子量的测定

采用 Agilent 1260 型高效液相色谱仪配备TSK-GEL GM PWXL柱和差示检测器（RID），通过高效排阻色谱（HPSEC）测定胞外多糖的纯度和平均分子量（Mw）。将各纯化组分（1.0 mg/mL，10 μL）用0.1 mol/L 的乙酸铵溶液在25 ℃下洗脱（流速为0.5 mL/min）。通过使用葡聚糖标准（Mw=12000 u、55000 u、150000 u、270000 u 和670000 u）绘制的校准曲线计算这六种胞外多糖的Mw。

1.5 基本成分及单糖组分分析

总糖含量采用苯酚-硫酸法[14]测定；测定蛋白质含量按Bradford 等[22]的方法；测定糖醛酸含量[23]和硫酸盐基含量[24]按Nelly 等[23]的方法，稍作修改；采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法测定其单糖组成。将样品用4 mol/L 的三氟乙酸（TFA）在120 ℃下水解2 h，使得到的单糖转化为糖腈乙酸酯衍生物。然后使用Agilent 7890B GC system-5977A MSD 配备HP-5 毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），温度梯度以3 ℃/min从120 ℃到210 ℃，使用火焰离子化检测器（FID）进行检测。

1.6 紫外及红外光谱分析

使用SHIMADZU UV-2450型紫外-可见分光光度计在190～500 nm 波长范围内记录EPSs 的紫外光谱。将纯化后的EPSs 与KBr 粉混合，研磨压制成粉末，使用IRAffinity-1 型傅立叶变换红外光谱仪（FT-IR）在4000～400 cm-1内的范围进行扫描。

1.7 甲基化分析

将胞外多糖甲基化的方法参考文献稍作修改[25]。组分分离和单糖转化为相应的甲基化糖醇醋酸酯的过程参考文献稍作修改[26]。甲基化糖醇醋酸酯的糖键的气相色谱-质谱分析采用HP-5 毛细管柱，以温度梯度为3 ℃/min，将温度升至210 ℃，接口温度为250 ℃，载气为氦（He），流率为1.0 mL/min，样品体积为10.0 μL，图谱使用NIST 11 谱库行检索。

1.8 核磁共振分析

将冷冻干燥的Lpb.plantarumNM18 所产各EPS纯化组分充分溶解于D2O 中，用Bruker AVANCE AV-500型核磁共振仪进行分析，以四甲基硅烷（TMS）为内标，25 ℃测定，在313 K 下记录1H NMR 和13C NMR 谱，化学位移（δ）用10-6表示。

1.9 数据处理

2 结果与分析

2.1 胞外多糖的分离纯化

Lpb.plantarumNM18 的MRS 发酵液培养经离心除菌体蛋白、乙醇沉淀多糖、去离子水复溶透析、真空冷冻干燥等过程得到295.0 mg 的CEPS。然后用不同浓度的NaCl 洗脱后共得到5 种组分（图1），分别标为EPS-1～5。组分EPS-1 用去离子水洗脱，为中性多糖；其余组分用不同浓度的NaCl 洗脱，为酸性多糖或者带有酸性基团的糖复合物。对5 种组分使用Sepharose CL-6B 柱进行进一步纯化（图2、图3），洗脱后最终得到6 种组分（EPS-1A、EPS-1B、EPS-2、EPS-3、EPS-4、EPS-5），浓缩、透析和冻干备用。

2.2 各EPS 纯化组分的纯度鉴定和分子量测定

Lpb.plantarumNM18 所产各EPS 纯化组分相对分子质量的高效液相色谱图（图4）中可知，6 种组分经过HPSEC 均得到一个单一的洗脱峰，峰形尖锐对称，所以各EPS 组分纯化为单一多糖。以葡聚糖为标准，按分子量由小到大依次进样求得回归方程，得到平均相对分子质量分别为 2.11×105、2.04×105、2.02×105、2.17×105、2.09×105、1.93×105u。

2.3 组分成分分析

胞外多糖组分成分分析（表1）可知，CEPS 和组分EPS-1A、EPS-1B、EPS-2、EPS-3、EPS-4 和EPS-5的总糖含量分别为75.25%、96.88%、95.98%、94.67%、80.06%、84.32%和70.38%。利用“考马斯亮蓝法”测定CEPS 的蛋白质含量为1.13%，组分EPS-4 的蛋白质含量高达7.22%，其他组分中未检出蛋白质。以“氯化钡-明胶比浊法”测定硫酸根含量分别为1.40%、0.22%、0.31%、0.26%、0.42%、6.30%和0.27%。用“硫酸-咔唑法”测定的糖醛酸含量分别为3.24%、0.23%、0.34%、0.25%、0.43%、0.54%和0.85%。

表1 CEPS 和各EPS 纯化组分的成分分析Table 1 Component analysis of CEPS and the purified EPS

2.4 紫外及红外光谱分析

菌株NM18 所产胞外多糖的紫外及红外光谱分析（图5）中得知，组分EPS-4 在260～280 nm 有一个较强的吸收峰，说明组分EPS-4 的蛋白质含量高于其他组分（EPS-1A、EPS-1B、EPS-2、EPS-3 和EPS-5 在该区域没有吸收峰，说明它们不含蛋白质）。组分EPS-1A、EPS-1B、EPS-2、EPS-3、EPS-4 和EPS-5的FT-IR 光谱（图6）显示，所有光谱均有明显的多糖吸收峰，表明均存在吡喃糖环。组分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 具有非常相似的FT-IR 光谱，具有α-D-Galp和α-D-Glcp基团；而组分EPS-4 具有N-H弯曲振动和S=O 伸缩振动，都具有较高的蛋白质和硫酸盐基含量。

2.5 单糖成分分析

气相色谱-质谱分析（图7）显示，组分EPS-1A由三种单糖组成，分别是D-Man（RT 26.906）、D-Glc（RT 27.247）和D-Gal（RT 27.938），比值为8.64:2.63:1。组分EPS-1B 也由D-Man（RT 26.966）、D-Glc（RT 27.372）和D-Gal（RT 28.012）组成，但比例为3.22:2.68:1。组分EPS-2 由D-Man（RT 27.088）、D-Glc（RT 27.281）和D-Gal（RT 27.969）组成，比值为8.23:1.03:1。因此，组分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2与L.plantarumKF5[27]、L.plantarumMTCC 9510[28]和L.plantarum7081[21]的单糖组成相似。组分EPS-3由L-Rha（RT 18.683）、L-Fuc（RT 19.59）、D-Man（RT 26.816）、D-Glc（RT 27.253）、D-Gal（RT 27.927）和N-Acetyl-D-glucosamine（RT 31.237）组成，比值为0.16:0.18:0.74:5.47:1.04:1。组分EPS-4 由D-Man（RT 26.815）、D-Glc（RT 27.19）、D-Gal（RT 27.912）和N-Acetyl-D-glucosamine（RT 31.219）组成，比值为1.49:0.36:1:2.49。组分EPS-5 由L-Fuc（RT 19.595）、D-Man（RT 26.813）、D-Allose（RT 27.19）、D-Gal（RT 27.969）和N-Acetyl-D-glucosamine（RT 31.316）组成，比例为0.91:1:0.11:6.73:4.82。根据以往研究，S.thermophilusMR-1C[29]含有岩藻糖，L.helveticusTY 1-2[30]、L.lactissubsp.CremorisLC330[31]、L.acidophilusLMG9433[32]、L.rhamnosusGG 和L.suebicusCUPV225/226 含有N-乙酰葡萄糖胺。

2.6 甲基化分析

甲基化和气相质谱分析（表2）显示，组分EPS-1A和EPS-1B 均由→3)-D-Glcp-(1→、→6-D-Galp-(1→、→4-D-Glcp-(1→和→6-D-Manp-(1→组成，末端残基为D-Glcp-(1→。组 分 EPS-2 由→6-D-Galp-(1→和→6-D-Manp-(1→组成，末端残基也为D-Glcp-(1→。结合一维核磁共振的结果，组分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的糖环为吡喃糖，包含α和β糖苷键。结果表明，与组分EPS-1A 和EPS-1B 相比，组分EPS-2 的糖苷键类型更少。

表2 EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的甲基化分析Table 2 Methylation analysis of EPS-1A,EPS-1B and EPS-2

2.7 核磁共振光谱（NMR）分析

从组分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的1H 的NMR图（图8）可知，4.7×10-6附近的谱峰对应水峰，3.2×10-6～4.0×10-6之间的峰值对应C2-C6质子信号叠加，不易解析。在4.8×10-6～5.5×10-6的组分EPS-1A 光谱中，有5 个与异头质子对应的化学位移，信号分别为 5.17×10-6、5.01×10-6、4.99×10-6、4.97×10-6和4.92×10-6，分别对应于组分EPS-1A 的五个糖残基（分别标记为A～E）。从异头信号的化学位移和耦合常数来看，A、B、C 和D 处于α构型，而E 处于β构型。

在4.8×10-6～5.5×10-6的组分EPS-1B 光谱中，也有5 个异头质子对应的化学位移，信号分别为5.26×10-6、5.16×10-6、4.98×10-6、4.90×10-6、4.83×10-6，分别对应于组分EPS-1B 的5 个糖残基（分别标记为A～E）。再从化学位移和耦合常数来看，A、B 和C 是α构型，D 和E 是β构型。

在4.8×10-6～5.5×10-6的组分EPS-2 光谱中，在5.18×10-6、5.00×10-6和4.93×10-6的非均相质子中有三个化学位移，表明组分EPS-2 糖链中含有三个糖残基（分别标记为A、B 和C）。我们得出结论A 和B 是α构型，C 是β构型。

组分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的13C 核磁共振谱图（图9）可知，组分EPS-1A 中有5 种不同的碳信号分别对应甘露糖、葡萄糖和半乳糖残基的α或β构型，而C-1 残基对应的峰值分别为105.29×10-6、102.16×10-6、102.12×10-6、102.10×10-6和100.50×10-6。

同样，组分EPS-1B 中有5 种不同的碳信号分别对应甘露糖、葡萄糖和半乳糖残基的α或β构型，C-1残基对应的峰分别为105.24×10-6、105.05×10-6、104.27×10-6、102.08×10-6和100.46×10-6。最后，组分EPS-2 中有三个对应α或β构型的峰，C-1 糖残基对应的峰分别为105.05×10-6、102.11×10-6和100.49×10-6。

3 结论

本研究从Lpb.PlantarumNM18 发酵液中分离出6 种胞外多糖组分，其中含两个中性组分（EPS-1A 和EPS-1B）。经GC-MS 分析得知，组分EPS-1A、EPS-1B和EPS-2 由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成；组分EPS-3由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺组成，还含有微量的鼠李糖和岩藻糖；组分EPS-4 由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺和岩藻糖组成；组分EPS-5 由阿洛糖、半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺组成。本研究报道Lpb.plantarum胞外多糖含有岩藻糖和N-乙酰葡萄糖胺，组分EPS-5 中含有罕见的阿洛糖，在乳酸菌胞外多糖中尚未见研究。对组分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 进行甲基化分析，结合FT-IR 光谱和NMR 光谱分析得知，尽管相对摩尔比不同，组分EPS-1A 和EPS-1B 具有相同的→3)-D-Glcp-(1→，→6-D-Galp-(1→，→4-D-Glcp-(1→，→6-D-Manp-(1→和D-Glcp-(1→的结构。同时，组分EPS-2 主要由→6-D-Galp-（1→，→6-D-Manp-（1→和D-Glcp-（1→组成。组分EPS-1A、EPS-1B 和EPS-2 的糖环为吡喃糖，糖苷键构型为α和β型的混合物。不同乳酸菌产生不同的胞外多糖，Lpb.plantarumNM18 所产胞外多糖的单糖组成和摩尔比明显丰富，因此值得期待做进一步分析。