生姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2022-07-29潘雪莉赵振军胡贤春

现代食品科技 2022年7期

潘雪莉，赵振军，胡贤春

（长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe）起源于东南亚沿海[1]，属姜科（Zingiberaceae）、姜属（Zingiber）的一种多年生草本植物[2]。生姜因其地下根茎肉质、气味芳香、滋味辛辣，深受人们喜爱，已经发展成为生活中必不可少的香辛料及保健蔬菜之一，目前我国大量栽种于的西南与华南等地区[3]。生姜以鲜食为主，但随着生姜产业的快速发展，生姜汁也逐渐发展成为生姜深加工产品中的一种重要选择[4]。

生姜汁富含多种生物活性成分，如生姜精油（萜烯类物质）、生姜多酚、生姜多糖、脂类、有机酸和生姜粗纤维等。在药用功能与保健作用方面，生姜精油具有清除自由基、抑制细菌、真菌生长等多种药理功效；姜辣素、姜烯酚、姜黄素等具有镇痛、抗炎、抑菌、抗癌、抗氧化等功效[5-7]；近年来，关于生姜活性成分在降血糖方面的作用及其机制的研究备受关注，刘富月[8]利用生姜提取物开展了糖尿病小鼠麦芽糖负荷，发现生姜提取物可以提高小鼠对糖的耐受量，并显著降低喂饲后小鼠的血糖值；Venkateswaran 等[9]利用微波辅助提取生姜多酚用于降糖活性研究，结果表明较低浓度的生姜多酚（6.25 μg/mL）即具有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性、并在研究中证实生姜多酚可以通过提高GLUT4基因表达量和细胞中胰岛素的活性，增强C2C12细胞对葡萄糖的摄取能力，达到最终降低血糖的效果。Chen 等[3]关于生姜多糖的研究也表明生姜提取物多糖类不仅能有效清除羟基自由基、超氧自由基还具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

生姜汁中还含有丰富的生姜蛋白酶等具催化活性的蛋白类物质[10]，前期的研究发现这些具催化活性的蛋白类物质严重影响鲜榨生姜汁存放过程中的品质变化，极易导致姜汁的褐化，并产生浑浊、絮状、沉淀等现象，而这些具催化活性的蛋白类物质在姜汁中是否影响姜汁的降糖作用及其在存放过程中降糖活性是否存在的动态规律至今未见报道。

本文以5 个不同地方产的生姜榨成姜汁，分别研究鲜姜汁、姜汁存放过程及其热处理过程对α-葡萄糖苷酶的抑制活性与抑制类型，旨在探讨姜汁降血糖的生物学活性，为生姜降血糖功能的深入研究和深加工产品的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试生姜源自5 个不同产地所产鲜姜，分别是山东临沂大姜、湖北恩施凤头姜、四川自贡小黄姜、云南文山小黄姜和贵州镇宁小黄姜；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，分析纯试剂，国药集团化学试剂上海有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside，PNPG），北京索莱宝科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase），Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

AB204-N 型电子天平，艾科仪器设备有限公司；HH-6 智能数显恒温水浴锅，上海越众仪器设备有限公司；DF-1 集热式磁力恒温搅拌器，金坛市江南仪器厂；TGL-16 台式高速冷冻离心机，浙江明德仪器有限公司；XD-2000B 型旋转蒸发器，上海贤德实验仪器有限公司；UV-4800 紫外可见分光光度仪，尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 姜汁的制备

选取5 个不同产地所产鲜姜洗净后切成小块状，用榨汁机榨汁，先用纱布粗滤，再经离心机离心分离（6000 r/min，15 min），取上清液经0.45 μm 滤膜过滤后，按照单位体积所含鲜姜质量，依次配成0.125、0.25、0.5、1.0、1.5 g/mL 5 个不同的浓度，冷藏备用。

1.3.2 不同品种及浓度姜汁对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

α-葡萄糖苷酶抑制活性测定参考沈佳奇等[11]的方法，略作修改，具体如下：准确移取0.01 mol/L PBS缓冲液0.4 mL，样品组和背景组加入不同浓度的生姜汁0.4 mL，样品组和阴性组加入0.3 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液0.4 mL，振荡均匀后于37 ℃恒温保存5 min，样品组、背景组和阴性组加入2.5 mmol/L PNPG 溶液0.4 mL，于37 ℃反应30 min 后加1.6 mL 0.2 mol/L Na2CO3溶液终止反应，以PBS 缓冲液为空白对照，于405 nm 处测定吸光度，每组重复3 次，按照公式（1）计算姜汁样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率：

式中：

OD背景——未加α-葡萄糖苷酶溶液吸光值；

OD阴性——未加姜汁的吸光值；

OD空白——不加姜汁和酶溶液的吸光值，体积不足部分加等体积缓冲液。

1.3.3 自然存放与热处理后姜汁对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

选择浓度为1.5 g/mL的山东临沂大姜姜汁为研究对象，在室温（25 ℃）和5 ℃的温度条件下存放0、1、2、3、4、5 d 后，依次分别取样测定存放过程的姜汁对α-葡萄糖苷酶活性抑制率；以存放5 d 后的姜汁为试材，在50、70、100 ℃分别加热10、30、60、120、240、300 min，依次分别取样冷却后，参照试验方法1.3.1 开展对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定，每组重复3 次，计算姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.3.4 不同分子量大小姜汁组分对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

对浓度为1.5 g/mL的山东临沂大姜姜汁分别采用3 ku 和10 ku 的超滤膜进行超滤，将姜汁按照分子量（Mw）大小分为三类：Mw≥10 ku、Mw 在3～10 ku之间、Mw≤3 ku。按照试验方法1.3.1 测定并计算不同分子量大小的姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.3.5 姜汁对α-葡萄糖苷酶抑制作用的动力学分析

利用PBS 缓冲液分别配制浓度为0、0.5、1.5 g/mL山东临沂大姜姜汁，设定底物PNPG 的浓度为2.5 mmol/mL，设置检测的时间间隔为1 min，分析不同α-葡萄糖苷酶浓度下（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U/mL）的酶促反应速率（反应速率则为吸光度的差值ΔOD值与时间t 的比值）。绘制α-葡萄糖苷酶浓度与酶促反应速率的关系曲线，判断抑制作用的可逆性。

设定α-葡萄糖苷酶浓度为0.3 U/mL，分别测定不同浓度姜汁（0、0.5、1.5 g/mL），在不同浓度底物PNPG（0.075、0.15、0.3、0.625、1.25、2.50 mmol/mL）作用下的酶促反应速率，以1/PNPG 与1/V 为横纵坐标，按Lineweaver-Burk 方程绘制曲线，确定抑制作用类型。

1.3.6 姜汁对α-葡萄糖苷酶紫外-可见光吸收光谱的影响

分别准确移取一定量0.075 g/mL 姜汁、0.075 g/mL 姜汁经超滤后分子量＜3 ku 的组分、0.075 g/mL姜汁经超滤后分子量＞10 ku 的组分、0.075 g/mL 姜汁经超滤后3 ku＜分子量＜10 ku 的组分、0.3 U/mLα-葡萄糖苷酶、0.15 g/mL 姜汁、0.3 U/mLα-葡萄糖苷酶与等体积浓度分别为0.15、0.3、0.75、1.5 g/mL 的姜汁混合（放置5 min 后），在190～800 nm 波长处的扫描分析紫外-可见光吸收光谱（以PBS 缓冲溶液作为参比调节基线，扫描分析均为山东临沂大姜姜汁）。

1.3.7 数据分析

应用Origin 2018 软件进行数据统计、分析与作图。

2 结果与讨论

2.1 不同品种及浓度姜汁对α-葡萄糖苷酶抑制作用结果

由图1 可知，5 个不同产地姜汁对α-葡萄糖苷酶都有不同程度的抑制作用，其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效率具有明显的地域或品种差异性，总体来看，山东临沂大姜姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最高，当姜汁浓度为1.5 g/mL 时，其抑制率可达到73.38%。同时姜汁的浓度显著影响对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率与姜汁的浓度呈正相关，随着姜汁浓度的增加，其对酶活性抑制率显著增加，如山东临沂大姜姜汁当浓度从0.125 g/mL 增加至1.5 g/mL，其对酶活性的抑制率从3.91%提高到73.38%。而在不同浓度层面，不同产地或品种姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用表现出不同的效果，如姜汁浓度为0.125 g/mL 时，姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果为：云南文山小黄姜＞山东临沂大姜＞四川自贡小黄姜＞湖北恩施凤头姜＞贵州镇宁小黄姜；而当姜汁浓度为1.5 g/mL 时，姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果为：山东临沂大姜＞云南文山小黄姜＞湖北恩施凤头姜＞四川自贡小黄姜＞贵州镇宁小黄姜。这可能与不同产地或品种的生姜中具有抑制酶活性的化学成分的含量及其在不同浓度下的存在形态有关[9,12]。

2.2 姜汁对α-葡萄糖苷酶抑制作用的动力学分析

在不同浓度姜汁（山东临沂大姜）的抑制作用下，分别在改变酶浓度（底物PNPG 浓度不变）和改变底物PNPG 浓度（酶浓度不变）的条件下测定姜汁抑制酶活性反应体系中的酶促反应速率，以α-葡萄糖苷酶的浓度为横轴，以酶促反应速率为纵轴作图2a，图2a显示酶促反应速率随着酶浓度的变化呈现线性拟合关系，随着姜汁浓度的增加，酶促反应速率呈现降低趋势，符合可逆抑制反应的特征，因此可以判断姜汁对α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有可逆性。以不同底物PNPG 的浓度为横坐标，以酶促反应速率为纵坐标作图2b，在酶浓度不变的条件下，酶促反应速率与姜汁浓度和底物PNPG 的浓度呈正相关。利用底物浓度与酶促反应速率的双倒数作曲线，见图3，发现不同浓度姜汁对应的拟合线性曲线均交于Y 轴的同一点，表明随姜汁浓度的变化，其曲线斜率随浓度增加而减小，但抑制酶活性反应的最大速率保持不变，由此判断姜汁在抑制α-葡萄糖苷酶活性反应体系中的抑制作用为可逆的竞争性抑制。

综上所述，高中政治文化生活板块中传统文化的教学渗透要利用课堂情境，渗透传统文化；利用实践活动，挖掘文化精髓；更新教师素养，渗透传统文化，最终确保中国传统文化融入工作思想政治教育的路径更为畅通。

生姜对α-葡萄糖苷酶活性具有强烈的抑制作用，刘富月等[8]研究34个不同产地的生姜提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果，发现云南罗平小黄姜乙醇提取物的抑制率最高，动力学实验表明小黄姜乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用是可逆非竞争性抑制[12]，本文在研究姜汁α-葡萄糖苷酶活性抑制过程中也发现姜汁对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用具有品种或产地及浓度差异性，但姜汁对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用表现为可逆竞争性抑制，可能姜汁中对α-葡萄糖苷酶活性发挥抑制作用的主要活性成分不同于小黄姜的乙醇提取物，因而导致抑制酶活性的机制存在差别。

2.3 贮藏过程中姜汁对α-葡萄糖苷酶抑制作用

以浓度为1.5 g/mL 山东大姜鲜姜汁为研究对象，分别测定在室温25 ℃和低温5 ℃条件下存放过程姜汁对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用动态变化，贮藏过程中姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率见图4a。结果表明姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率呈显著下降趋势，5 ℃存放姜汁的酶活性抑制率从71.32%降为30.69%，25 ℃存放姜汁的酶活性抑制率从72.27%降为32.61%，同时其对酶活性抑制率的下降也受存放温度的影响，低温5 ℃存放姜汁的酶活性抑制率下降速率（存放3 d 后抑制率为33.17%，仅为初期抑制率的46.5%）要高于室温25 ℃存放的姜汁。可能与低温条件下姜汁中含有丰富的蛋白质和多酚等类等有关，蛋白质在低温下空间结构会发生变化，会促进其他物质与之相互作用，更容易发生缔合作用[13]。

2.4 热处理条件下姜汁对α-葡萄糖苷酶抑制作用

将浓度为1.5 g/mL的山东临沂大姜鲜姜汁在低温下经过5 d 的贮存后，分别在50、70、100 ℃条件下进行热处理，测定热处理过程中姜汁对α-葡萄糖苷酶活性抑制率，结果见图4b。结果显示，当贮存后的姜汁经过50、70、100 ℃热处理后，姜汁对酶活性的抑制率快速增加，温度越高增速越快，热处理4 h 后对酶活性的抑制率达到最高，100 ℃条件下加热4 h 后姜汁对酶活性的抑制率接近恢复至鲜姜汁的水平，达到60.11%，而热处理4 h 后，姜汁对酶活性的抑制率开始显著下降。

姜汁中活性物质含量丰富，无论在室温还是低温条件下贮藏姜汁常表现为易褐化、产生絮状沉淀等现象，而经过存放后的姜汁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用显著下降，可能与姜汁贮藏过程具有抑酶活性的物质与姜汁中的大分子如蛋白类等发生缔合作用有关，缔合作用的发生会制约其对酶的抑制活性，而存放后的姜汁经过热处理抑酶活性显著提高，说明抑酶活性物质缔合作用的产物不稳定，通过热处理有助于解络合作用的发生[13]。

2.5 不同分子量姜汁组分对α-葡萄糖苷酶抑制作用

采用超滤膜分离的方法对同一浓度的姜汁（山东临沂大姜姜汁，浓度为1.5 g/mL）按照分子量进行分级，依次分为Mw≥10 ku、Mw 在3 ku～10 ku 之间和Mw≤3 ku，分别测定其对α-葡萄糖苷酶活性抑制率（图5）。由图5 可知，Mw≥10 ku 的姜汁组分对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果最好，最高可以达到67.16%，而Mw≤3 ku 的姜汁组分对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果较差，抑制率仅为13.65%。Mw 在3～10 ku 之间的姜汁组分对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果在上述二者之间，抑制率为28.62%。结果表明姜汁中发挥抑制酶活性的物质主要集中在Mw≥10 ku 组分中。

2.6 不同分子量姜汁紫外-可见光谱分析

对浓度为0.075 g/mL 的姜汁及其超滤组分（Mw≤3 ku、Mw≥10 ku、3 ku＜Mw＜10 ku）分别进行紫外可见光谱扫描，结果如图6 所示。由图6 的光谱图可知，姜汁及其超滤组分在波长200～240、240～260、260～280 及390～420 nm 等处均有显著的吸收峰，说明姜汁中含有核酸、蛋白质等有机物。在波长220～240 nm 处，姜汁超滤组分的吸收峰显著高于原姜汁，说明经过超滤后姜汁中在此波段有吸收峰的物质浓度显著提高；在波长240～260、260～280 nm 处，超滤组分吸收峰与分子量呈正相关，与原姜汁相比，超滤后姜汁Mw≥10 ku 组分和3 ku＜Mw＜10 ku 组分中在此波段有吸收峰的物质浓度显著提高，姜汁Mw≤3 ku 组分中在此波段有吸收峰的物质浓度略有降低。

2.7 姜汁对α-葡萄糖苷酶紫外-可见吸收光谱的影响分析

图7 为不同浓度的姜汁与α-葡萄糖苷酶相互作用后的紫外-可见吸收光谱。α-葡萄糖苷酶在220 nm 处有最大吸收峰，不同浓度姜汁（0.15、0.3 g/mL）在220～280 nm 处均有较大吸收峰，0.15 g/mL 姜汁、0.3 g/mL 姜汁与0.3 U/mLα-葡萄糖苷酶混合后，虽然α-葡萄糖苷酶的吸收峰不显著，但是与单纯的姜汁的吸收光谱相比，姜汁与α-葡萄糖苷酶的混合液在240～260 nm 和260～280 nm 处的吸光值明显降低，在其他可见光波段处混合液的吸光值也表现为显著降低。

生姜对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用源于生姜的活性成分。生姜不同溶剂的粗提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率不同，其中乙醇提取物的抑制率最高[12]。进一步的研究表明，生姜中具有降糖活性的物质主要有黄酮[14]、姜辣素[15]和生姜多糖[3]等物质，本研究姜汁在与α-葡萄糖苷酶互作的体系中，发现姜汁在紫外吸收光谱240～280 nm 波段处，吸光值显著降低，说明姜汁中的核酸、蛋白酶、酚类氧化酶等物质可能参与了对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。在多种有机物同时存在的分子体系中，有机物间极易通过分子自组装或分子拼接等方式，形成新物质[16]。姜汁活性成分是否通过分子拼接等方式发挥对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用尚待进一步研究。