李 华， 王伟亮， 谢 贝， 杨 瑜， 孟繁荣， 王 楠， 刘志辉， 张言斌

（1.广州市胸科医院肺部疾病研究所，广东 广州 510095；2.佛山市第四人民医院结核病防治科，广东 佛山 528000；3.广州市胸科医院结核内科，广东 广州 510095）

耐药结核病给结核病的防治工作带来了极大的挑战，世界卫生组织在2020年全球结核年报中指出，2019年全球估算新发利福平（rifampicin，RFP）耐药结核病病例46.5万例，其中78%为耐多药结核病，有18.2万例患者死于耐多药结核病[1]。结核异质性耐药是指在同一样本中同时存在对药物敏感和耐药的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）。快速、灵敏、特异地检测MTB异质性耐药可有针对性地指导临床用药，大大提高结核病的治愈率。目前，应用于结核异质性耐药检测的技术包括表型法和基因法。表型法检测大约需要3～4周，下一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）和限制性片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism，RFLP）可发现MTB菌群基因序列的不一致，从而揭示MTB菌群的异质性[2-6]，但该方法只能检测与表型明确相关的耐药基因突变[7-8]。

流式细胞术（flow cytometry，FCM）可用于白念珠菌、MTB、金黄色葡萄球菌等微生物的药物敏感性检测[9-12]，该方法基于表型检测细菌的药物敏感性，具有高效、准确的优点。相关研究证实了FCM可用于检测伤寒沙门菌和酵母细胞的异质性[13-14]。本研究团队前期研究结果显示，基于荧光素双醋酸酯（fluorescein diacetae，FDA）或碘化丙锭的FCM在MTB RFP药物敏感性检测中具有较高的检测效率和效能[15]。本研究以广州市胸科医院MTB菌株库为基础，进一步探究基于FDA的FCM检测RFP异质性耐药MTB样本RFP耐药菌比例的可行性，评估FCM在耐RFP MTB异质菌液样本检测中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

RFP敏感MTB临床分离株和耐RFP MTB临床分离株均为广州市胸科医院“广州地区分枝杆菌菌种保藏库”保存菌株。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂 FACSAria Ⅱ流式细胞仪（美国BD公司）；BACspreader 1100细菌超声分散仪（广东体必康生物科技有限公司）；Middlebrook 7H10固体培养基、Middlebrook 7H9液体培养基、OADC（美国BD公司），FDA（美国LIFE公司），RFP（美国SIGMA公司）。

1.2.2 菌液制备 采用随机数字表法从生物样本库中挑选RFP耐药和敏感MTB临床分离株各100株，复苏培养。挑选生长良好的MTB单菌落，将全敏感MTB接种于7H10固体培养基（10%OADC），耐药RFP MTB接种于含1 μg/mL RFP的7H10固体培养基（10% OADC），培养3代，并进行比例法药物敏感性试验。挑选生长状况良好的MTB，刮取菌落至7H9培养液（10%OADC），用细菌超声分散仪配置成1麦氏浊度菌悬液。随机选择1对RFP敏感MTB临床分离株和耐RFP MTB临床分离株，按RFP耐药MTB比例为0%、25%、50%、75%和100%进行混合，配制成RFP异质性耐药MTB混悬液，共30组。所有活菌相关操作均在生物安全柜中进行。

1.2.3 菌液的RFP处理 充分混匀菌液，移取1 800 μL菌液于无菌试管中，分别加入浓度为0、125、250、500和1 000 μg/mL的RFP工作液（用7H9培养液稀释）200 μL，充分混匀，使RFP终浓度分别为0、12.5、25、50和100 μg/mL，置于37 ℃恒温箱中孵育，分别在用RFP处理的第3、7和10天后行FDA染色。异质菌液用50 μg/mL的RFP作用10和14 d后进行FDA染色。

1.2.4 菌液的FDA染色和FCM检测 取1 000 μL待检菌液于无菌试管中，15 000×g离心10 min，去掉上清，加入1 000 μL 0.9%NaCl溶液，用超声分散仪分散，取300 μL菌液于流式细胞仪上样管中，加入300 μL FDA工作液（0.5 μg/mL，磷酸盐缓冲液配置），混匀，避光染色30 min后，用流式细胞仪检测，记录其平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）值。

1.2.5 RFP异质性耐药检测药物处理浓度和作用时间的确定 计算各处理组的敏感指数（实验管MFI/对照管MFI）。为了检测到异质性菌液中最低混合比的耐药菌，理想的药物处理浓度和作用时间应既不影响混合菌液样本中微量耐RFP MTB临床分离株的生长，又能使混合菌液样本中RFP敏感MTB临床分离株的敏感指数最低，即背景信号降到最低，此时耐RFP MTB临床分离株和RFP敏感MTB临床分离株染色的敏感指数差异最大，检测灵敏度最高。分别用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP处理RFP敏感MTB临床分离株3、7 和10 d后，比较不同处理时间FDA染色敏感指数间的差异，确定最佳药物处理时间。通过比较MTB临床分离株经12.5 、25 、50和100 μg/mL的RFP处理10 d后的FDA染色敏感指数间的差异，确定最佳药物处理浓度。

1.2.6 比例法药物敏感性试验 按照《实验结核病学》中“结核分枝杆菌药物敏感性试验”操作方法进行比例法药物敏感性试验[16]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。正态分布计量数据用±s表示，两两比较采用两独立样本t检验或校正t检验，多组比较采用单因素方差分析；非正态分布计量数据用中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，两两比较采用两独立样本秩和检验，多组比较采用Kruskal-WallisH秩和检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价不同比例异质菌液的敏感指数界值和检测性能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基于FDA的FCM检测MTB RFP异质性耐药的药物处理浓度和作用时间

分别用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP作用RFP敏感MTB临床分离株3、7和10 d，结果显示，不同作用时间FDA染色的敏感指数差异有统计学意义（P<0.001）；分别用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP作用RFP敏感MTB临床分离株和耐RFP MTB临床分离株10 d后，不同药物浓度处理组FDA染色的敏感指数差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

图1 基于FDA的FCM检测MTB RFP异质性耐药的药物处理浓度和作用时间分析

2.2 基于FDA的FCM检测MTB RFP异质性耐药的性能

用50 μg/mL RFP作用10、14 d后，不同比例RFP耐药MTB的异质菌液样本FDA染色的敏感指数见表1。用50 μg/mL RFP作用10、14 d，基于FDA的FCM对含有0% RFP耐药MTB的异质菌液样本和含有25%及以上RFP耐药MTB的异质菌液样本具有较高的鉴别效能；对含有25%RFP耐药MTB的异质菌液样本和100% RFP耐药MTB的异质菌液样本也具有较高的鉴别效能；对其他比例RFP耐药MTB的异质菌液样本之间的鉴别效能较低。见表2、图2、图3。

表1 50 μg/mL RFP作用不同比例RFP耐药MTB异质菌液样本10、14 d后FDA染色敏感指数

表2 RFP异质性耐药MTB经50 μg/mL RFP作用后FDA染色敏感指数的ROC曲线分析结果

图2 RFP异质性耐药MTB经50 μg/mL RFP作用后FDA染色敏感指数的ROC曲线

图3 30组RFP异质性耐药MTB混悬液经50 μg/mL RFP处理后FDA染色敏感指数的分布

3 讨论

结核病异质性耐药的本质是致病MTB为药物敏感菌群和耐药菌群的混合，当患者感染异质性耐药MTB时，如果根据其感染异质性耐药MTB中耐药MTB和敏感MTB的比例，制定个性化的治疗方案[17]，可大大提高该类结核病治疗的成功率。本研究团队前期研究结果表明，基于FDA染色的FCM能够高效、准确地鉴定MTB的RFP敏感性，这为应用FCM检测MTB异质性耐药提供了实验基础[15]。

基于FDA的FCM检测MTB RFP异质性耐药的本质是通过染料监测细菌在药物处理后的活力。FDA是一种具有细胞膜透性的疏水荧光素衍生物，其进入细胞后可被细胞内的酯酶催化水解生成发绿色荧光的荧光素，不具有完整细胞膜或新陈代谢活性弱的细胞会因酯酶失活而降低水解FDA的能力。为了确认基于FDA的FCM在MTB RFP异质性耐药检测中合适的RFP处理浓度和作用时间，本研究对不同RFP处理浓度作用不同时间后，MTB RFP敏感或耐药临床分离株经FDA染色后的敏感指数进行了差异性分析，结果显示，分别用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP处理RFP敏感MTB临床分离株3、7和10 d后，3 d处理组、7 d处理组和10 d处理组之间FDA染色的敏感指数差异均有统计学意义（P<0.001），提示RFP敏感MTB临床分离株经RFP处理的时间越长，其活力越差，基于FDA染色的FCM检测MTB RFP异质性耐药的药物处理时间可以选择10 d或更长；分别用12.5、25、50和100 μg/mL的RFP处理RFP敏感MTB临床分离株和耐RFP MTB临床分离株10 d后，不同药物浓度处理组之间FDA染色的敏感指数差异均无统计学意义（P>0.05），但用100 μg/mL的RFP处理后，耐RFP MTB临床分离株敏感指数明显低于用50 μg/mL RFP处理的敏感指数，提示用100 μg/mL RFP处理对耐药MTB的活力有影响，基于FDA染色的FCM检测MTB RFP异质性耐药较优的RFP处理浓度为50 μg/mL。

本研究结果显示，基于FDA的FCM在检测MTB RFP异质性耐药时，较合适的药物处理条件是50 μg/mL RFP处理10 d，既不影响异质菌液样本中RFP耐药MTB的生长，又可使样本中RFP敏感MTB的敏感指数最低。本研究摸索实验的最长时间是10 d，不排除增加时间后会使RFP敏感MTB临床分离株敏感指数下降到更低，而耐RFP MTB则不受影响，故在后续RFP异质性耐药检测中增加了处理14 d的研究。我们用基于FDA的FCM检测30组耐RFP MTB所占比例分别为0%、25%、50%、75%和100%的MTB RFP异质性耐药菌液样本，通过ROC曲线分析其检测不同比例MTB RFP异质性耐药菌液的敏感指数界值和检测效能，结果显示，50 μg/mL RFP处理10 d时，基于FDA的FCM在MTB RFP异质性耐药检测中鉴别含0%、25%和100% RFP耐药MTB的异质菌液样本的敏感指数界值分别为0.48和0.83，敏感性分别为96.2%和86.7%，特异性分别为96.7%和83.3%；处理14 d时，该方法鉴别含0%、25%和100% RFP耐药MTB的异质菌液样本的敏感指数界值分别为0.37和0.77，敏感性分别为96.7%和96.7%，特异性分别为93.3%和86.7%，提示50 μg/mL RFP处理10和14 d时，基于FDA的FCM均可准确区分含0%、25%和100%RFP耐药MTB的异质菌液样本，且处理14 d的检测性能略优于处理10 d，耗时与比例法（3～4周）相比大大减少。在指导临床用药方面，当异质样本中RFP耐药MTB比例为0%～25%时，说明样本中耐药菌比例较低，敏感菌比例较高，如果在治疗早期加入RFP，或可明显加快痰液样本病原菌转阴速度，缩短治疗时间。

本研究预实验尝试评估了基于PI的FCM用于MTB RFP异质性耐药检测的效能，该方法无法用于MTB RFP异质性耐药样本的检测，可能原因为不同的RFP耐药临床分离株之间活力差异较大，经药物处理后PI染色的MFI值及敏感指数差异较大，导致相同比例下，含有不同耐RFP MTB临床分离株的异质菌液样本经PI染色所得敏感指数变异较大，无法分析得到统一的界值用于检测。截至文章撰写之日，尚未见该方法在MTB异质性耐药检测方面的其他研究报道。与比例法相比，FCM可检测单个粒子的荧光强度，FDA可不依赖于细菌的增殖检测细菌活力，因而理论上基于FDA的FCM在异质性耐药检测方面具有快速、高效的优点，这对于慢生长菌的异质性耐药检测意义重大[15，18]。DE BOER等[7]发现，RFLP等基因型检测技术能检测出混合比例为1∶9的异质性菌液，但只能检测与表型明确相关的耐药基因突变，无法识别未明确的耐药基因，准确率较低。因此，与基因型检测相比，基于FDA的FCM是基于表型的检测方法，能避开基因型异质性耐药检测存在的耐药基因突变位点不明、耐药基因突变与表型不符等问题[19]，检测的准确性较基因检测高。本研究中基于FDA的FCM可在10 d内准确区分含0%、25%和100%RFP耐药MTB的异质菌液样本，耗时远低于比例法，但是依然不够理想。可能原因为FDA是细胞内酯酶依赖的荧光素，药物作用后酯酶的失活需要一定的时间。因此，在FCM法检测细菌异质性耐药的研究中，寻找一种可灵敏指示细胞活力的染料将有助于缩短检测所用的时间，提高检测的灵敏度。