朱赟洁， 马峥尧， 沈敏娜， 周 琰， 黄 斐， 陈馨宁， 张春燕， 王蓓丽， 郭 玮

（复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032）

结直肠癌是一种好发于老年男性人群的恶性肿瘤，发病率居所有恶性肿瘤的第3位，病死率居第2位，其发病率与年龄有关，但近年来有年轻化的趋势[1]。有研究发现，有35%～45%的结直肠癌患者存在KRAS基因突变，约有15%的转移性结直肠癌患者存在BRAF基因突变，约有5%的结直肠癌是由微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）高或错配修复缺陷（different mismatch repair，dMMR）导致的，还有一些结直肠癌与PIK3CA基因突变、HER2扩增和NTRK基因融合等有关[2]。美国国立综合癌症网络（the National Comprehensive Cancer Network，NCCN）发布的结直肠癌诊疗专家共识明确指出，对实施抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向治疗的转移性结直肠癌患者需明确BRAF、KRAS和NRAS基因的突变状态[3]。

传统的组织活检存在创伤性，且取材范围受限，无法实时反映肿瘤的变化；而液体活检作为一种便捷、非侵入性的检测方法，可多次取材、实时反映肿瘤异质性的变化，为肿瘤的个性化诊疗提供参考依据，在结直肠癌早期诊断、预后判断、复发监测、化疗和靶向治疗等方面均有较好的临床价值[4]。肿瘤患者体内循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）除正常细胞来源外，还有凋亡肿瘤细胞释放到血液中的DNA小片段，即循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。ctDNA的基因组谱与相应肿瘤的基因组谱匹配率较高，对分子病理学和临床肿瘤学均有重要意义[5]。由于体细胞突变只存在于肿瘤细胞DNA，而这些DNA是特异的可被检测和追踪的生物标志物，其临床价值优于临床常用的癌胚抗原、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等蛋白标志物[6]。随着下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的发展，通过检测cfDNA指导肿瘤的临床诊疗变得更加切实可行。根据我国《医疗器械监督管理条例》[7]的规定：对于国内尚无同品种产品上市的体外诊断试剂，符合条件的医疗机构根据本单位的临床需求，可以自行研制，在执业医师指导下在本单位内使用。目前尚无用于cfDNA检测的商品化试剂盒，因此本研究拟基于NGS平台建立检测结直肠癌患者cfDNA的方法，并根据《我国医学检验部门自建检测方法发展与管理建议》[8]和《实验室自建分子诊断项目基本要求专家共识》[9]中的试剂盒性能评价要求进行临床应用评估。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年8月—2019年12月复旦大学附属中山医院经病理学检查确诊的晚期结直肠癌患者39例，其中男22例、女17例，年龄31～78岁；39例患者中有22例为初诊未治患者，收集这22例患者采用突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）检测肿瘤组织中靶向药物相关基因突变的结果。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 Ion Chef instrument系统、Ion S5 XL高通量测序仪、Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度PCR仪、ABI 7500 PCR仪均购自美国ThermoFisher Scientific公司。2100生物分析仪购自美国Agilent公司。Qubit荧光定量仪购自美国Invitrogen公司。Agencourt核酸纯化试剂盒购自美国贝克曼库尔特公司。0.2 mL PCR管式磁分离架购自美国Permagen Labware公司。

1.2.2 商品化参考品 野生型和预期突变位点为PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、KRASG12D、BRAFV600E、MAP2K1 Q56P、NRASQ61K、CTNNB1 S33Y，突变频率为0.1%、0.2%、0.5%的商品化参考品（货号为HD817）购自英国Horizon Discovery公司。野生型和预期突变位点为PIK3CAH1047R、NRASQ61R、KRASQ61H、KRASG12D、BRAFV600E、ERBB2 A771_Y772insYVMA、AKT1 E17K，突变频率为0.1%、0.2%、0.5%的商品化参考品（货号分别为0710-0672、0710-0673、0710-0674）购自美国SeraCare公司。

1.2.3 自制参考品EPS3 根据结直肠癌患者血浆cfDNA检测系统（简称结直肠癌cfDNA panel）所覆盖的位点，将结直肠癌及肺癌细胞系（商品化人结肠癌细胞HT-29、人非小细胞肺癌细胞NCI-H1650、人肺腺癌细胞NCI-H1975、人结肠癌细胞HCT-116、人结直肠腺癌细胞HCT-15）DNA和人源基因组DNA打断至平均片段长度为170 bp，用表观健康者来源的基因组DNA（野生型）稀释至期望突变频率为0.1%、0.2%和0.5%。自制参考品EPS3覆盖的预期突变分别为PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、KRASG13D、BRAFV600E。

1.2.4 其他试剂 MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit、Oncomine Colon cfDNA Assay、Ion Library TaqMan Quantitation Kit、Ion 540 Kit-Chef芯片、Ion 540 Chip Kit均购自美国ThermoFisher Scientific公司。Qubit dsDNA HS assay购自美国Invitrogen公司。High Sensitivity DNA Kit购自美国Agilent公司。QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit购自德国QIAGEN公司。比对方法中通用文库构建试剂盒和核酸纯化试剂盒均购自上海安可济生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本的采集、处理和检测 采用Vacutainer采血管（美国BD公司）采集所有患者静脉血20 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝。1 581×g离心10 min，分离血浆，置于2 mL Eppendorf管中，然后再以16 873×g离心10 min，获得乏细胞血浆，吸出血浆，置于新的2 mL Eppendorf管中，-80 ℃保存待检。基于NGS平台构建结直肠癌cfDNA panel，由MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit、Ion Library TaqMan Quantitation Kit、Ion 540 Kit-Chef芯片、Ion S5 XL高通量测序仪和Oncomine Colon cfDNA Assay组成。采用MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit抽提血浆中的cfDNA，并采用Qubit dsDNA HS assay进行cfDNA定量，总量≥10 ng，片段分布主峰约为170 bp，且无明显的基因组污染（无或仅有少量>2 000 bp的片段）。使用Ion Library TaqMan Quantitation Kit构建抽提后的cfDNA文库，根据实时荧光定量PCR的浓度结果计算文库稀释比例，确保文库混合后总体积>25 μL，终文库总量>100 pmol/L。取稀释后的子文库等体积混合，加载于Ion 540 Kit-Chef芯片并测序。采用Torrent Suite Software 5.10.0软件和Ion Reporter Software 5.10.1.0软件（美国ThermoFisher Scientific公司）对测序数据进行生物信息学分析，对实验操作、样本测序数据和变异位点数据进行质量控制，同时对结果作出解释。

1.3.2 Miseq Dx二代测序平台 比对方法为Miseq Dx二代测序平台，由Fire fly建库策略（上海安可济生物科技有限公司）和Illumina二代测序平台（美国Illumina公司）构成。采用NGS检测4个经NCCN指南批准的与结直肠癌相关的基因（KRAS的2、3和4号外显子，NRAS的2、3号外显子，BRAF的15号外显子，PIK3CA的9、20号外显子）。

1.4 方法学评价

1.4.1 准确性 采用结直肠癌cfDNA panel检测12份不同配比的商品化参考品和自制参考品，统计各参考品的突变位点及其检出次数，并与预期结果比较，计算准确度。可接受标准：最终用于计算的样本须通过文库和测序质量控制标准，与预期结果比较，准确度应≥90%。

1.4.2 精确性 取突变频率为1.0%的自制参考品EPS3，检测PIK3CAE545K、KRASG13D、TP53 S241F、BRAFV600E、TP53 R273H和PIK3CAH1047R。（1）批内精密度：在同一次试验中重复检测3次，计算均值（x）、中位数（M）、标准差（s）和变异系数（coefficient of variation，CV）。（2）批间精密度：连续检测3 d，每次重复检测3次，计算x、M、s和CV。（3）重复性：分别由2位检测人员进行检测，重复检测18次。（4）可接受标准：将cfDNA用Qubit dsDNA HS assay进行定量检测，同一操作者批内定量结果的CV<20%，批间定量结果的CV<40%，cfDNA的提取回收率>30%。最终用于计算的样本须通过文库和测序质量控制标准，变异阳性符合率和阴性符合率应均为100%。

1.4.3 参考区间 结直肠癌相关体细胞基因突变参考区间为“未检测到突变”。

1.4.4 可报告范围 对于NGS可测定的基因区域，结直肠癌cfDNA panel共覆盖14个基因（AKT1、ERBB2、NRAS、APC、FBXW7、PIK3CA、BRAF、GNAS、SMAD4、CTNNB1、KRAS、TP53、EGFR、MAP2K1）的242个热点变异位点，主要为单碱基突变和插入缺失标记。

1.4.5 用于抽提的最少样本量 对1和2 mL起始量的血浆进行提取，每份起始血浆样本批内重复提取3次，并与4 mL起始量的血浆比较。可接受标准：采用Qubit定量检测提取后得到的cfDNA，从1、2、4 mL血浆样本中提取的cfDNA量应大致成比例增加，且cfDNA的回收率>30%。

1.4.6 cfDNA的最低检测量 取正常人血浆样本，分别加入10、20和50 ng的自制参考品EPS3（突变频率为0.5%），检测PIK3CAE545K、KRASG13D、TP53 S241F、BRAFV600E、TP53 R273H和PIK3CAH1047R突变，每份样本重复检测3次。可接受标准：最终用于计算的样本须通过文库和测序质量控制标准，变异阳性符合率应为100%，cfDNA最低检测量应在通过验证的最低值和最高值之间。

1.4.7 分析灵敏度 在分子检测领域，分析灵敏度是指用该分子检测技术能够测到生物样本中待测靶核酸分子的最低含量。对突变频率为0.2%的自制参考品EPS3重复检测20次。根据本平台建议的最低检测量为20 ng cfDNA，中位测序深度≥7 500×。可接受标准：最终用于计算的样本须通过文库和测序质量控制标准，阳性检出率应≥95%。

1.4.8 分析特异性 在2份野生型和2份突变型（预期突变为BRAFV600E，经过微滴式数字PCR验证）血浆（4 mL）中分别加入10 000 mg/L血红蛋白（美国Sigma-Aldrich公司，批号SLBR9638V）、500 mg/L胆红素（美国Sigma-Aldrich公司，批号SLBX1739）或2%脂肪乳（四川科伦药业股份有限公司，批号F17060801）。采用MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit进行抽提，检测BRAFV600E突变。比较干扰物加入前后的检测结果。

1.5 临床应用评估

分别采用结直肠癌cfDNA panel和Miseq Dx二代测序平台检测17例晚期结直肠癌患者血浆中靶向药物相关基因（AKT1、ERBB2、NRAS、APC、FBXW7、PIK3CA、BRAF、GNAS、SMAD4、CTNNB1、KRAS、TP53、EGFR、MAP2K1）的突变丰度，比较2种检测系统结果的一致性。采用结直肠癌cfDNA panel检测22例初诊未治结直肠癌患者血浆中靶向药物相关基因的突变丰度，并与ARMS检测结果进行比较。ARMS与本平台共同覆盖的位点为：KRAS的2、3、4号外显子，NRAS的2、3号外显子，PIK3CA的20号外显子、BRAF的15号外显子。

2 结果

2.1 方法学评估结果

2.1.1 准确性 采用结直肠癌cfDNA panel检测商品化参考品和自制参考品EPS3，并与预期结果进行比较，准确性为99.97%，Kappa值为0.99。见表1。

表1 准确性试验结果 次

2.1.2 精确性 抽提精确性符合要求，且抽提所得样本通过文库和测序质量控制标准，重复检测18次，对预期突变的检出率均为100%。精确性符合要求。见表2。

表2 精确性结果

2.1.3 用于抽提的最少样本量 对1、2和4 mL血浆进行提取的总回收率分别为46.00%、45.90%和52.28%，且cfDNA的回收率均>30%，结果均能满足要求。因此，最小样本量为1 mL血浆。

2.1.4 cfDNA投入量 重复检测3次突变频率为0.5%的10 ng自制参考品EPS3，已知突变均可正确检出。故最低检测量为10 ng cfDNA。

2.1.5 分析灵敏度 采用结直肠癌cfDNA panel对突变频率为0.2%的自制参考品EPS3重复检测20次，6个基因突变位点（BRAFV600E、KRASG13D、PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、TP53 R273H、TP53 S241F）的阳性检出率为100%，故分析灵敏度为0.2%。由于本实验室经过性能确认的NGS检测平台的分析灵敏度均为0.2%，因此考虑到NGS的检测性能，同时也为保持报告的一致性，本研究仅验证突变频率为0.2%的自制参考品EPS3。

2.1.6 分析特异性 2份野生型血浆样本和2份突变型血浆样本在干扰物加入前、后的突变检出结果一致，定性结果一致率为100%。提示10 000 mg/L血红蛋白、500 mg/L胆红素或2%脂肪乳对结直肠癌cfDNA panel检测cfDNA无影响。见表3。

表3 分析特异性结果

2.2 临床应用评估

结直肠癌cfDNA panel与Miseq Dx 二代测序平台共同覆盖的基因为KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA。采用2种检测系统测定17例晚期结直肠癌患者血浆中靶向药物相关基因的突变丰度，其中有16例患者2种检测系统的检测结果在共同覆盖基因位点上一致，有1例患者的检出结果虽一致，但结直肠癌cfDNA panel的检测结果低于既定的检测下限，故2种方法的一致性为94.12%（16/17），满足临床检测的需求。其中检出最多的突变位点为KRAS的2号外显子，17例患者中出现了6例。见图1。

图1 结直肠癌cfDNA panel与Miseq Dx二代测序平台的一致性

结直肠癌cfDNA panel检测22例结直肠癌患者血浆中靶向药物相关基因突变丰度与ARMS检测肿瘤组织的一致性为90.91%（20/22）。突变位点出现最多的基因为TP53、APC和KRAS，占总突变的62.22%。见图2。

图2 结直肠癌cfDNA panel与ARMS的一致性

3 讨论

NCCN 2009年发布的结直肠癌诊治指南推荐检测晚期结直肠癌患者KRAS基因[10]；2010年发布的结直肠癌诊治指南建议对KRAS基因野生型患者进一步检测BRAF基因V600E突变来预测患者是否可以从抗EGFR单克隆抗体治疗中获益[10]；2018年发布的结直肠癌诊治指南建议，对所有伴有转移性结直肠癌患者进行KRAS、NRAS、BRAF基因检测，以指导用药[11]。2019.V1版的NCCN结直肠癌诊治指南新增BRAF基因作为指导治疗的指标和基于检测EGFR的治疗方法[12]。在结直肠癌患者中，NRAS基因总突变率约为3.9%[13]，因此NRAS基因的突变状态对于结直肠癌患者靶向药物治疗的选择同样具有重要意义[14]。与结直肠癌密切相关的经典的原癌基因有BRAF、C-myc、PIK3CA、KRAS、NRAS、c-fos、c-jun、c-raf、src、abl、fps等[15]。与结直肠癌密切相关的经典的抑癌基因有APC、DCC、p53、PTEN、Rb、RUNX3、NDRG2、p16、DPC4、KLF6等[16]。

NCCN发布的结直肠癌诊治指南强调了NGS对于结直肠癌相关突变基因联合检测的应用价值，还有研究指出NGS在围手术期ctDNA动态监测中的价值[17]。由此可见，NGS在结直肠癌临床诊疗中可以为患者提供更加完善的个体化诊疗方案。

对比两组患儿治疗的临床疗效，评判标准[2] ：显效，患儿经过相关治疗后，临床症状呼吸困难、咳嗽、喉鸣等显著改善；有效，患儿经过相关治疗后，临床症状呼吸困难、咳嗽、喉鸣等有一定改善，但未完全改善；无效，患儿经过相关治疗后，临床症状呼吸困难、咳嗽、喉鸣等没有任何好转迹象，甚至加重；总有效率=显效率+有效率。

与有商品化试剂的检测项目不同，实验室自建项目在应用于临床前需要进行更加严谨的性能确认，包括开展项目的应用目的、样本类型、采集和运送样本的程序、样本拒收标准、临床应用指征以及方法的准确性、精确性、分析灵敏度和抗干扰能力等。本研究主要对结直肠癌cfDNA panel检测结直肠癌相关基因突变的定性试验的各项性能指标进行了评估。

对于定性分析来说，准确性是指与比对试验或标准方法检测结果的相关性。本研究结果显示，采用自建的结直肠癌cfDNA panel检测商品化参考品和自制参考品EPS3的Kappa值为0.99，表明自建平台准确性极高；检出3个假阴性结果，分别出现在货号为HD817（突变频率为0.2%）和货号为0710-0672（突变频率为0.2%）的商品化参考品中，其中有2个假阴性结果（未测得KRAS和PIK3CA突变）出现于同一个商品化参考品（货号0710-0672）中，其余1个假阴性结果是在商品化参考品（货号HD817）中检出KRAS突变。由于这2个商品化参考品的突变频率较低时可能会出现结果不稳定的情况，因此结直肠癌cfDNA panel的检测结果接近分析灵敏度时，应考虑使用更加灵敏的数字PCR进行复核。

与临床常用的BEAMing等结直肠癌相关基因检测技术相比，本研究使用的结直肠癌cfDNA panel可在短时间内完成对上百亿碱基的测序[18]，同时保持了高准确性。本研究结果显示，结直肠癌cfDNA panel的分析灵敏度为0.2%，而具有相同分析灵敏度的高分辨率熔解曲线只能测定已知突变，且成本较高[19]。

本研究结果显示，500 mg/L胆红素和2%脂肪乳对结直肠癌cfDNA panel检测cfDNA均无干扰，虽然加入10 000 mg/L血红蛋白后血浆样本的抽提不受干扰，但样本溶血后会导致基因组DNA被释放入血，对于肿瘤细胞等体细胞突变阳性结果的检出有一定影响[20]，因此样本出现溶血时建议重新采血进行检测。

由于不同NGS平台的检测原理不同，常会导致结果差异较大，因此本研究将结直肠癌cfDNA panel与Miseq Dx二代测序平台的检测结果进行比较，结果显示，17例晚期结直肠癌患者中有16例2种检测系统的检测结果一致，有1例虽检出相同的突变，但由于结直肠癌cfDNA panel检测结果低于分析灵敏度而被排除，可能与该例样本突变频率较低，经过冻存后突变频率进一步降低有关。因此，当结直肠癌cfDNA panel的检测结果低于检出下限时，可以采用数字PCR进行复核。

高洁等[21]等采用靶向NGS平台Ion Torrent PGM检测甲醛固定石蜡包埋结直肠癌组织标本KRAS2号外显子及扩展RAS突变，并与Sanger测序和ARMS比对，结果显示Ion Torrent PGM平台与Sanger测序、ARMS的一致性为100%。提示NGS平台在检测靶向药物相关基因突变时具有较好的检测性能。本研究结果显示，结直肠癌cfDNA panel与ARMS的一致性为90.91%，其中有2例不符合，该2例样本均为化疗后采样，肿瘤负荷和突变位点可能因化疗而发生了变化。与ARMS相比，结直肠癌cfDNA panel投入量更小，可同时检测多种突变，并可依据检测结果对治疗方案作出实时调整。

Miseq Dx二代测序平台有桥式累计错误、荧光信号干扰等不足[22]，而本研究使用的NGS平台具有测序速度快、通量大、后续数据处理简洁等优势，且灵敏度和特异性均较好，因此适用于临床常规检测。此外，运用NGS检测基因突变可节省样本与时间，性价比高，在结直肠癌相关基因突变检测方面具有重要的临床应用前景。

有研究结果显示，组织样本与胸腔积液、腹腔积液样本的基因突变检出率相当，且均高于血浆cfDNA的突变检测率[23]。但本研究结果显示，在22例初诊结直肠癌患者的血浆样本与组织样本检测结果的比对中，除组织ARMS检测未能覆盖到的基因位点变异外，其他基因突变检测结果均一致。提示检测血浆cfDNA可以满足临床需求。

本研究采用结直肠癌cfDNA panel检测结直肠患者血浆cfDNA，不仅可以作为组织样本检测的补充验证或实时监测患者的疗效及耐药性变化，同时还可作为结直肠癌患者的初步筛查指标。对于结直肠癌患者来说，结直肠癌cfDNA panel可以进行KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因联合检测，为临床个体化靶向药物治疗提供更准确的理论依据。由于受到患者匹配度和检测成本的限制，本研究用于验证的患者样本数有限，后续将收集更多患者样本进一步验证。

综上所述，结直肠癌cfDNA panel作为实验室自建项目，具有高准确性、高特异性等优势，有助于结直肠癌患者的个体化诊疗，具有广阔的临床应用前景。但由于我国目前尚无针对NGS咨询的原则和操作规范，因此检出基因突变后，如何向临床医生或患者进行基因变异的解释是临床实验室面临的难题，这需要在未来的实践和研究中不断总结。