王 冲， 朱 捷， 杨 烁， 顾梅秀， 潘柏申， 王蓓丽， 郭 玮

（复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032）

浆膜腔积液常规检查作为实验室检测的重要组成部分，在漏出液和渗出液、癌性和非癌性积液、结核性和非结核性积液的鉴别诊断以及寻找致病原因等方面有重要意义。在日常工作中，虽然显微镜人工计数法（手工法）为白细胞计数和分类的金标准，但标本充池、人工计数和标本推片、染色、分类等操作对人员要求较高，不易标准化，且检测过程耗时较长。相比人工计数法，全自动血液分析仪（仪器法）检测耗时短、效率高，能提高计数准确性、精密度和重复性，易于标准化。为此，本研究拟探讨全自动血液分析仪体液模式在浆膜腔积液标本细胞计数和白细胞分类检测中代替人工计数法的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集复旦大学附属中山医院住院患者各类浆膜腔积液标本287例，包括胸腔积液171例、腹腔积液90例、心包积液26例。所有标本均由临床医生采集，采用乙二胺四乙酸二钾抗凝，并在采集后2 h内完成细胞计数和白细胞分类检测[1]。所有标本均排除肉眼可见的凝块，仪器法检测排除异常细胞、细胞分类散点图异常，以及高荧光强度细胞升高的标本。

1.2 仪器与试剂

XN-20 A1全自动血液分析仪及配套试剂（日本Sysmex公司）；CX-31型显微镜（日本Olympus公司）；血细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；瑞氏-吉姆萨染液（珠海贝索生物技术有限公司）。

1.3 仪器法细胞计数准确性评估

在标本采集2 h内分别用手工法和仪器法对287例浆膜腔积液标本进行红细胞计数、白细胞计数检测，以手工法为金标准，评估仪器法细胞计数的准确性。

1.4 仪器法白细胞分类准确性评估

标本采集2 h内对手工法白细胞计数>50个/μL的252例标本（排除3例异常白细胞高值标本）进行白细胞分类，将标本以400 ×g离心5 min，取沉淀物推片制成均匀薄膜，经干燥、染色、冲洗后，对有核细胞进行分类，计算单个核细胞、多个核细胞和嗜酸性粒细胞的百分比；同时用XN-20 A1全自动血液分析仪体液模式对252例标本进行白细胞分类。参照WS/T 246—2005《白细胞分类计数参考方法》[2]，以手工法各分类细胞百分比的95%可信区间为判断标准，统计仪器法细胞分类结果与手工法的符合率。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示，检测结果比较采用配对t检验和方差检验，数据相关性评价采用线性回归分析，一致性评价采用Bland-Altman图。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 仪器法细胞计数准确性评估结果

2.1.1 仪器法与手工法白细胞计数结果的相关性 对于手工法白细胞计数为201～400个/μL（40例）和401～15 000个/μL（212例）的标本，2种方法白细胞计数结果相关性较好（r值分别为0.873和0.993，P<0.05），见表1。配对t检验结果显示，白细胞计数为0～200个/μL（32例）时，仪器法检测结果高于手工法（P=0.013）；人、而白细胞计数为201～400个/μL和401～15 000个/μL时，2种方法检测结果差异无统计学意义（P=0.134、P=0.246）。一致性分析结果显示，白细胞计数为0～200个/μL时，有26组结果在95%可信区间内，一致性较差；白细胞计数为201～400个/μL和401～15 000个/μL时，分别有39组和206组结果在95%可信区间内，一致性较好；见图1。手工法白细胞计数>15 000个/μL的标本，有3例标本仪器法与手工法检测结果有差异（表2）；镜检发现1号标本中存在大量破碎白细胞和脓细胞，仪器法检测值明显高于手工法，因此类标本只有3例，无法进行统计，后续也不再进行红细胞计数和白细胞分类的比较。

表1 2种方法白细胞计数结果相关性分析

图1 2种方法白细胞计数结果相关性和一致性分析

表2 3例异常白细胞高值标本2种方法检测结果 个/μL

2.1.2 仪器法与手工法红细胞计数结果的相关性 对于手工法红细胞计数>200个/μL的标本，2种方法红细胞计数结果相关性均较好（P<0.05），见表3。配对t检验结果显示，红细胞计数为0～200个/μL（26例）时，仪器法检测值>手工法检测值，但2种方法检测结果无相关性（r=0.035，P=0.621）；一致性分析结果显示，有23组数据位于95%可信区间内。红细胞计数>200个/μL时，配对t检验结果显示2种方法差异无统计学意义（P>0.05），一致性分析结果显示2种方法一致性较好。见图2。

表3 2种方法红细胞计数结果相关性分析

图2 2种方法红细胞计数结果相关性和一致性分析

2.2 仪器法白细胞分类准确性评估结果

仪器法与手工法白细胞分类检测均将白细胞分为单个核细胞、多个核细胞、嗜酸性粒细胞3类，仪器法对3类白细胞的检测结果与手工法相关性较好（r值分别为0.998、0.971、0.977，P<0.05），见表4。配对t检验结果显示，单个核细胞、多个核细胞2种方法结果差异无统计学意义（P=0.740、P=0.580）；嗜酸性粒细胞仪器法检测值高于手工法检测值（P=0.007）。一致性分析结果显示，2种方法单个核细胞、多个核细胞结果的一致性较好；而嗜酸性粒细胞虽然大部分数据位于95%可信区间内，但在分析低值标本时，嗜酸性粒细胞仪器法检测值高于手工法，2种方法一致性较差；见图3。

表4 2种方法白细胞分类结果相关性

图3 2种方法白细胞分类结果相关性和一致性分析

3 讨论

浆膜腔积液是大量液体潴留浆膜腔内而形成的积液，按积液部位不同分为胸腔积液、腹腔积液、心包积液[1]。浆膜腔积液常规检查可鉴别积液性质，为临床诊断、治疗提供依据。传统的显微镜镜检是细胞计数和白细胞分类的金标准，但标本充池质量直接影响细胞计数的准确性；进行涂片分类时，标本离心速度易影响细胞形态，沉淀物黏稠度、涂片后固定时间、环境温度等均会对涂片质量产生影响；对高浓度标本，多倍稀释会因稀释误差导致最终计数不准确。总体来讲，手工法操作复杂、耗时长，不易标准化，不同操作人员间结果可比性较差，开发新的方法对于浆膜腔积液细胞计数和白细胞分类检测非常重要。

2014年，国际血液学标准化委员会（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）成立了体液细胞自动计数仪性能和验证国际工作组，为提供准确而可靠的自动化仪器体液的细胞计数结果，发布了有助于临床实验室计划和实施的自动化细胞计数仪验证指南。指南中指出，实验室应建立自动化仪器检测体液细胞计数的线性范围，对超出线性范围的标本，应稀释后进行检测，或使用其他检测方法[3]。采用自动血液分析仪体液模式，配合商品化质控品，可大大提高浆膜腔积液细胞计数和白细胞分类的准确性、重复性和精密度，易于实现标准化[4]。本研究对287例浆膜腔积液标本进行红细胞和白细胞计数，并对其中252例标本进行白细胞分类检测，样本量大，结果更可靠，更具有临床应用价值。

本研究根据手工法白细胞计数对标本进行分组。当白细胞计数为201～400个/μL和401～15 000个/μL时，仪器法与手工法白细胞计数结果相关性较好（r值分别为0.873和0.993，P<0.05）；对于32例白细胞计数≤200个/μL的标本，仪器法与手工法检测值和存在一定差异，且无相关性（r=0.032，P=0.333），但由于样本量较少，还需进一步分析，建议在体液白细胞数量较少时，采用手工法计数。本研究中，有3例白细胞计数>15 000个/μL的标本，2种方法检测结果差异较大，镜下观察发现1号标本中存在大量破碎白细胞和脓细胞，仪器法检测值明显高于手工法。建议此种情况下，在报告中注明“见大量脓细胞”；对此类白细胞高值标本，可适当稀释后用仪器法结合手工法进行计数。XN-20 A1全自动血液分析仪体液模式可对大多数体液标本中的白细胞进行准确计数，但对白细胞计数≤200个/μL或>15 000个/μL的标本，建议用手工法进行复检。

本研究根据手工法红细胞计数对标本进行分组统计，发现红细胞计数>200个/μL时，2种方法相关性较好。然而在XN-20 A1全自动血液分析仪体液模式下，红细胞检测通道最低检出限为0.000 1×106个/μL，标本中红细胞数量较少时（≤1 000个/μL），仪器法能检测到的最少数量为100个/μL；红细胞数量增加时，仪器法检测值也只能以整百的数量级递增，而浆膜腔积液中出现少量红细胞多因穿刺损伤所致，红细胞较多则提示为血性渗出液，多见于恶性肿瘤、结核和其他出血性疾病。因此，尽管当体液中红细胞计数为201～1 000个/μL时2种方法结果相关性较好，但在红细胞计数≤1 000个/μL时，建议采用手工法对红细胞进行准确计数，以便为临床诊疗提供可靠信息。对于红细胞计数>1 000个/μL的体液标本，可采用仪器法计数报告结果。

浆膜腔积液白细胞分类是临床鉴别漏出液和渗出液主要依据。本研究结果显示，白细胞计数>50个/μL的252例标本，2种方法单个核细胞、多个核细胞、嗜酸性粒细胞结果相关性较好；但对于低值标本，仪器法嗜酸性粒细胞的检测结果往往偏高，主要原因可能为仪器法检测白细胞分类的最低检出限为0.001×103个/μL，导致在细胞数量较少时，更易表现为细胞计数不准确。临床送检的浆膜腔积液标本多以异常为主，其中肿瘤患者标本居多，此类标本可能存在较多间皮细胞、肿瘤细胞。有研究结果表明，有核细胞形态应根据细胞散点图并结合镜下观察综合分析，高荧光参数值越高，检出异常细胞和肿瘤细胞的可能性越大。还有研究发现，恶性肿瘤患者体液标本中，高荧光参数值细胞的识别率明显更高，当仪器提示标本中有较多高荧光参数值细胞时，也需要进行镜下分析[4-5]。因此，当仪器提示可能存在细胞分类散点图异常或高荧光强度细胞数异常时，应进行手工法复检，校正仪器分类结果[6]。浆膜腔积液标本的性状和送检时间对于标本的检测结果也至关重要，仪器法检测较为澄清的标本结果较为准确，对于浑浊或黏稠的标本，仪器法检测结果往往会出现偏差；另外，浆膜腔积液标本是否及时送检也会影响最终结果，送检时间过长会使细胞碎裂，造成仪器法计数偏低[7-8]。

综上所述，XN-20 A1全自动血液分析仪体液模式对浆膜腔积液标本进行细胞计数和白细胞分类具有快速、准确、重复性好等优势，可广泛应用于临床检测。但对于部分细胞数或细胞类型存在异常的标本，仍需使用手工法进行复检。