袁 诺，张 清，张小飞，彭义交，郭 宏，赵金红

（北京食品科学研究院，北京 100068）

卤蛋是以新鲜鸡蛋为原料，经水煮、去壳、调味卤制、腌制等工序制作而成的休闲蛋制品，因其口感弹韧、风味独特、营养丰富、食用方便而深受消费者喜爱。为了延长商品的货架期，食品生产企业通常采用真空包装和热杀菌抑制商品中微生物的生长繁殖，从而延缓腐败时间。虽然低温等离子、超高压、脉冲强光等新型非热杀菌技术有良好的杀菌效果，但因为设备和技术等原因，热杀菌技术仍然是目前最普遍采用的杀菌方式。常用的热杀菌方式根据温度可分为90 ℃以下的低温杀菌、90～110 ℃的中温杀菌和110 ℃以上的高温杀菌。低温杀菌如巴氏杀菌可较好地保留原料的营养成分和风味，但出品后需全程冷藏且保质期较短，常用于乳制品和啤酒等快销品行业。当前市场中大部分肉、蛋制品均使用121 ℃进行杀菌，高温杀菌产品中的微生物基本被全部杀灭，具有很长的贮藏期。但杀菌过程中110 ℃以上的高温会对产品的营养、风味及口感造成较大损失或劣变。随着社会发展、生活质量的提升，消费者对食物品质和营养水平的要求日益增高，在一些产品的加工中，中温杀菌技术受到科研人员及市场的关注，成为杀菌应用的新趋势。经中温杀菌的产品虽然可以有效地延长保质期并保留营养和风味物质，但无法完全灭杀细菌芽孢等小部分极耐热微生物。目前，鲜有关于中温和高温杀菌卤蛋贮藏期内微生物和脂肪酸组成变化的比较研究。因此，本实验利用95、105 ℃和121 ℃不同杀菌温度对真空包装卤蛋进行杀菌，并将样品分别于4 ℃和25 ℃进行贮藏，测定并分析各样品在贮藏期间内菌落总数和脂肪酸组成的变化，以期为卤蛋生产加工中杀菌和贮藏温度的选择提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

产后一周以内的新鲜海兰褐壳鸡蛋（产蛋鸡35 周龄）由北京二商金健力有限公司提供。

食盐、酱油、香料（包括八角、白芷、小茴香、桂皮、橘皮、山柰、草果、砂仁、甘草、白胡椒、花椒、高良姜、姜、月桂叶、丁香）均为市售。

氢氧化钠、氯化钠、正己烷、硫酸氢钠、氢氧化钾、无水硫酸钠、三氯甲烷（均为分析纯） 北京化工厂；三氟化硼乙醚络合物、无水甲醇（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；37种脂肪酸甲酯混合标准品（色谱纯） 上海安谱实验科技股份有限公司；正己烷（色谱纯） 天津福晨化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2020气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；杀菌釜 诸城中泰机械有限公司；Hei-VAP Advantage旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；DZ400/2D真空包装机 浙江葆春包装机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卤蛋制备

卤蛋制备参照袁诺等的方法稍作修改。1）预煮：将鸡蛋放入98 ℃水浴锅中煮制30 min后，取出冷激并去壳备用；2）卤汤熬制：按水的质量添加卤料1.2%、食盐1.2%、白砂糖2%、生抽酱油2%，使用电磁炉1 200 W熬制1 h；3）卤制：剥壳后的鸡蛋，以料液比为1∶3（/）加入卤汤，95 ℃水浴卤制2 h；4）装袋：将卤蛋装入复合薄膜蒸煮袋，用抽真空设备封口包装；5）杀菌：将真空包装后的卤蛋样品进行杀菌，根据前期实验基础，本研究选择的热杀菌条件为：95 ℃杀菌45 min、105 ℃杀菌45 min、121 ℃ 杀菌45 min。

根据不同的杀菌温度和贮藏温度将样品分为5 组进行贮藏实验。第一组为95 ℃杀菌、25 ℃贮藏（95/25组）；第二组为95 ℃杀菌、4 ℃贮藏（95/4组）；第三组为105 ℃杀菌、25 ℃贮藏（105/25组）；第四组为105 ℃杀菌、4 ℃贮藏（105/4组）；第五组为121 ℃杀菌、25 ℃贮藏（121/25组）。

每贮藏15 d取样品进行菌落总数和脂肪酸组成指标检测，贮藏实验周期为90 d。根据GB 2749—2015《食品安全国家标准 蛋与蛋制品》的规定，再制蛋检出菌落总数应小于10CFU/g，当样品菌落总数超过限定值时停止对超标样品的后续检测。

1.3.2 菌落总数测定

菌落总数按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定。

1.3.3 脂肪酸组成的测定

蛋黄油脂的提取：取样品5个，剥去蛋白，捣碎蛋黄并准确称取30 g，放入具塞锥形瓶中，加入180 mL氯仿-甲醇混合液（2∶1，/）混匀，将锥形瓶放入超声波仪中以功率350 W超声提取30 min。过滤后加入20 mL、质量分数0.88% NaCl溶液促进溶液分层，剧烈振荡混匀后转入分液漏斗静置分层，保留下层。下层溶液3 000×离心10 min，抽去上清液，保留下层澄清橙黄色溶液。对下层溶液进行75 ℃减压旋转蒸发1 h后，75 ℃水浴氮吹至恒质量得蛋黄脂质。提取的油脂放入棕色瓶中，0 ℃下冷藏备用。

卤蛋蛋黄油脂的皂化和甲酯化参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》中的外标法。

脂肪酸检测的气相色谱分析条件为：SH-Rt-2560毛细管色谱柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；氦气为载气；流速1.0 mL/min；分流比15∶1；进样口温度240 ℃；升温程序：柱温起始温度130 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至190 ℃，保持5 min，再以1 ℃/min升至210 ℃，保持5 min，再以4 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。定量方法采用外标法，以色谱峰面积计算提取的油脂中各种脂肪酸的含量（g/100 g）。

1.4 数据统计及分析

数据采用Excel 2016和SPSS 17.0软件进行统计分析，每个指标实验做3 次平行，结果用平均值±标准差表示，采用Duncan’s法进行差异显著性分析，＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同组别卤蛋贮藏期间内微生物生长情况

刚产出的鸡蛋无菌或仅带少量的细菌，但在鸡蛋贮藏、运输以及生产加工等环节中，环境中和生产设备上的微生物会污染原料和中间品。这些初始污染微生物中的一种或几种主导了食品的腐败变质，称为特定腐败菌。各组别样品贮藏期内的菌落总数变化情况如表1所示，3种温度在杀菌完成时都可以杀死样品中的活体微生物。随着贮藏时间的延长，第一组卤蛋（95/25组）在贮存15 d时开始检测到微生物，并于30 d时包装内出现浑浊汤液，卤蛋表面软烂且有酸臭味，严重腐败。同样25 ℃下贮藏的第三组（105/25组），在第75天检测出了微生物数增长，在之后的15 d微生物以低于第一组的繁殖速度致使样品轻度腐败，较95 ℃杀菌25 ℃贮藏的样品延长贮藏期60 d。第五组121 ℃杀菌的样品（121/25组）在25 ℃下贮藏90 d未发现微生物增殖。说明提高杀菌温度可有效热损伤和灭杀芽孢体，使活体芽孢数量减少，受损芽孢需要长时间调整和修复，致使芽孢杆菌的增殖起始时间后延并降低其增殖速度，在常温贮存下，当微生物修复并适应环境后，会快速增殖。由于10 ℃以下不适于芽孢杆菌等微生物的增长繁殖，所以在4 ℃贮藏的样品其微生物起始增殖时间和增殖速度都会比常温贮藏下延长和增加。第二组（95/4组）在75 d时微生物开始增殖，但第90天微生物并未超标；而第四组（105/4组）在90 d内未发现微生物增殖，说明低温贮藏对微生物增殖有明显的抑制作用。对卤蛋状态和培养基中的微生物菌落形态进行观察，发现腐败菌中没有霉菌，皆为细菌属。这表明杀菌和真空包装造成的低氧环境可有效遏制霉菌的生长繁殖。贺燕等对市售鸡蛋干进行了腐败微生物鉴定，确认地衣芽孢杆菌（）和芽孢杆菌LAMI 002（sp. LAMI 002）为腐败细菌。宋思家等发现鸡蛋干的核心致腐微生物为芽孢杆菌属，乳杆菌属和狭义梭菌属会加速鸡蛋干的腐败变质。弓敏等从鸡蛋壳表面分离纯化得到5种典型菌株，确定腐败能力最强的为蜡样芽孢杆菌属A、C，其次为大肠杆菌E、枯草芽孢杆菌B及考克氏菌D。

表1 不同组别卤蛋贮藏期内的菌落总数Table 1 Total bacterial count in marinated eggs from different groups during storage

2.2 贮藏期内各组卤蛋脂质脂肪酸组成的变化

2.2.1 贮藏期内各组卤蛋饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸总含量的变化

鸡蛋黄中富含脂肪、磷脂等营养成分，脂质的脂肪酸组成和含量是评价卤蛋营养价值、风味以及氧化稳定性等卤蛋品质的重要特征指标。贮藏期间内，各组卤蛋饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）总含量变化分别如图1、2所示。在初始杀菌完成时，随着杀菌温度的升高，样品中的SFA和MUFA总含量总体呈增加趋势。这是由于高温使多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）氧化分解为MUFA和SFA，当温度升高时，PUFA氧化速率也随之增高。MUFA在高温下也会发生氧化反应转化为SFA，使得其含量增加，但因MUFA自身只有一个双键相对较为稳定，其自身发生氧化降解的速率比PUFA要低很多，因此MUFA含量还是呈增加趋势。SFA因为不含不饱和键而结构稳定，不易反生氧化分解，当温度高于150 ℃时，才会发生热分解反应或在霉菌等微生物的影响下发生酮型酸败。25 ℃贮存条件下，95/25组的SFA和MUFA总含量在第15天便明显减少，与菌落总数开始增加的时间一致；在贮存至第15天和严重腐败的第30天时，SFA总含量由杀菌完成时的20.357 g/100 g分别降至18.999 g/100 g和18.107 g/100 g，分别降低了6.67%和11.06%；MUFA总含量由31.282 g/100 g分别降至29.987 g/100 g和27.546 g/100 g，分别降低了4.14%和11.94%。相同贮存条件下，105/25组在第45天SFA总含量明显减少，在第75天由20.797 g/100 g下降至19.590 g/100 g，降低了5.80%；MUFA总含量在第60天出现明显变化，第75天由31.450 g/100 g降至29.422 g/100 g，降低了5.57%。121/25组SFA总含量在贮藏前60 d无明显变化，在第75天时略有下降，第90天时由21.145 g/100 g下降至20.748 g/100 g，降低了1.88%；121/25组MUFA总含量在第60天出现下降，第90天时，由31.858 g/100 g降至30.919 g/100 g，降低了2.95%。95/4组样品SFA和MUFA总含量也出现了下降趋势。在第90天时，SFA总含量由20.357 g/100 g降至18.144 g/100 g，降低了10.87%；MUFA总含量由31.282 g/100 g降至27.423 g/100 g，降低了12.34%。而105/4组样品中的SFA和MUFA的总含量并无明显的变化趋势。

图1 贮藏期内各组卤蛋SFA总含量的变化Fig. 1 Variation in total saturated fatty acid (SFA) content in marinated eggs from each group during storage

图2 贮藏期内各组卤蛋MUFA总含量的变化Fig. 2 Variation in total monounsaturated fatty acids (MUFA) content in marinated eggs from each group during storage

分析实验数据变化趋势可以得出，同组别SFA和MUFA总含量随贮存时间变化的趋势和减少量基本一致，且与样品的菌落总数变化趋势高度相关，而各组别间含量变化有明显差异。目前，国内外在污水处理方面关于油脂降解菌株筛选鉴定的大量文献报道表明，自然环境中的细菌、霉菌及酵母菌具有油脂降解能力。而细菌中的葡萄球菌属、产碱杆菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属等因油脂降解能力出色而作为油脂分解菌被培养。王帮香等从松树油脂中分离得到一种野生油脂分解菌，并鉴定为蜡样芽孢杆菌。鸡蛋黄中的脂质可作为微生物生长繁殖的营养物质，且其中富含的铁、镁等可促进菌体分泌脂肪酶，致使样品中SFA和MUFA总含量降低。而不同杀菌和贮藏方式会使样品中微生物种类及增殖速度存在差异，进而导致各组别间明显的含量差异及不同的变化趋势。95 ℃杀菌的样品中，SFA和MUFA含量降低速度快，105、121 ℃杀菌25 ℃贮藏可延缓二者含量降低速度，105 ℃杀菌4 ℃贮藏可较好地保留样品中的SFA和MUFA。

2.2.2 各组卤蛋贮藏期间SFA和MUFA组成的变化

贮藏期间内，各组别的SFA和MUFA组成的变化分别如表2、3所示。各组别SFA中的C和C含量总体显著降低。在25 ℃下贮藏的样品C含量总体也呈降低趋势。MUFA中，各组别的C含量均减少，95/25、95/4及105/25 3 组的C含量总体显著降低，而另外两组只有微小变化；105/25组和121/25组的C含量显著降低。这可能是由于大部分微生物在生长繁殖过程中更多分解利用SFA，而杀菌条件导致了样品中有特殊微生物生长增长，造成了MUFA组分的差异变化。根据脂肪酸组成变化情况可以推测，95/25、95/4和105/25组样品中生长繁殖的微生物种类和数量要多于105/4组与121/25组。

表2 各组卤蛋贮藏期间SFA组成的变化Table 2 Changes in SFA composition of marinated eggs from each group during storage

表3 各组卤蛋贮藏期间MUFA组成的变化Table 3 Changes in MUFA composition of marinated eggs from each group during storage

2.2.3 各组卤蛋贮藏期间PUFA总含量及其组成的变化

各组别的PUFA总含量及其组成的变化分别如图3和表4所示。当杀菌完成时，随着杀菌温度逐渐升高，PUFA总含量呈降低趋势。相较于95 ℃杀菌的PUFA总含量，经105 ℃和121 ℃杀菌其含量分别下降了1.56%和6.83%。这是由于加温加压可以促使蛋黄中的甘油三酯和磷脂水解，释放出游离脂肪酸，而游离脂肪酸中的PUFA在高温环境下极不稳定，易发生氧化分解反应。在氧化分解的过程中，PUFA双键相邻的亚基碳原子上C—H σ键发生均裂，生成活性氢原子和游离基，游离基会与氧气反应生成过氧化物游离基，然后此过氧化物游离基又和一分子脂肪酸发生反应，生成过氧化物和新的游离基。过氧化物极不稳定，易分解为短链的醛、酮。温度越高，则产生游离基的速度越快，游离基所诱发的链式反应则越多，受到自由基攻击的PUFA也就越多。整个贮藏期间，PFUA总含量变化最小的为105/4组，降低了12.06%，其次为121/25组（12.61%）、95/25组（14.95%）、95/4组（16.65%）和105/25组（19.05%）。

图3 贮藏期内各组别PUFA总含量的变化Fig. 3 Variation in total PUFA content in marinated eggs from each group during storage

由表4可以看出，贮藏期间各组主要减少的脂肪酸为C、C和C，而C（二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA））含量在4 ℃贮存的两组中无显著变化。薄膜真空包装可有效阻隔氧气渗入，降低PUFA的氧化速度。李赵敏等发现酥油真空包装6个月后其MUFA和PUFA各组分含量及总含量总体无显著变化。105/4组和121/25组受到微生物生长繁殖的影响较小，造成其PUFA变化的主要影响因素是杀菌过程中高温导致的自由基数量增加造成的链式氧化分解反应。而121/25组杀菌温度和贮存温度比105/4组更高，所以其PUFA含量减少量也更多。前3 组（95/25组、95/4组、105/25组）的PUFA含量既受到微生物生长繁殖的影响，也受到贮藏时间、贮藏温度和自由基引发的自发氧化影响，所以这3 组PUFA总含量减少得也更多。因此，PUFA含量和组成变化的差异是杀菌条件、贮藏条件、贮藏时间、微生物生长以及自发氧化等多方面因素影响的结果。

表4 各组别贮藏期间PUFA组分的变化Table 4 Changes in PUFA composition of marinated eggs from each group during storage

2.2.4 各组卤蛋贮藏期间脂肪酸总含量的变化

从图4可以看出，在最初杀菌完成时，各组别脂质总脂肪酸含量基本相同。而随着贮藏时间的延长，各组别均出现了总脂肪酸含量不同程度地减少，各组别总脂肪酸含量的变化与样品菌落总数的变化呈较强的相关性，但不完全一致。这可能是因为由于环境中大多数微生物处于“存活但不能培养”或难培养的状态。传统的微生物培养基检测菌落总数作为分析微生物种群的手段，无法全面地检测出样品中微生物的存活情况，若要更清晰地分析样品中微生物种类，需要进一步采用高通量等技术进行鉴定，但现有数据也具有较强的参考价值。95/25组的样品，贮存30 d时脂肪酸总含量大幅下降（降低12.25%）并严重腐败，而121/25组在60 d贮藏期内脂肪酸总含量仅下降4.35%，95/4组和105/25组样品的总脂肪酸含量在贮存期间内持续下降。105/4组样品在第45天时脂肪酸总含量（64.310 g/100 g）超过了121/25组的样品（63.893 g/100 g），且较好地保持了PUFA水平，从脂肪酸含量变化规律推测，其保质期将长于121/25组的样品。

图4 贮藏期内各组卤蛋脂肪酸总含量的变化Fig. 4 Changes in the total amount of fatty acids in marinated eggs from each group during storage

3 结 论

本实验研究了不同杀菌温度和贮藏温度的卤蛋在贮藏过程中蛋黄脂质脂肪酸含量和组成的变化。研究结果表明，与95、105 ℃杀菌相比，121 ℃杀菌会大幅降低卤蛋初始的PUFA水平；95 ℃杀菌的卤蛋虽然初始PUFA总含量最高，但随着贮藏时间的延长，其中微生物快速生长繁殖，致使脂肪酸总含量快速降低，在常温30 d的期间降低了12.25%，并腐败变质，不适用于企业的生产销售。市面常用的121 ℃杀菌卤蛋常温贮藏60 d期间微生物繁殖速度慢，脂肪酸总含量下降幅度小（4.35%）。中温105 ℃杀菌的卤蛋初始PUFA总含量介于95 ℃和105 ℃卤蛋之间，为12.423 g/100 g，在25 ℃贮藏条件下具有75 d的保质期，可应用于开发短保质期的高营养产品。若使用4 ℃贮藏，中温105 ℃杀菌卤蛋不仅PUFA的总含量高于121 ℃杀菌的卤蛋，在贮藏45 d后总脂肪酸含量（64.310 g/100 g）高于121 ℃杀菌卤蛋（63.893 g/100 g）。根据脂肪酸与微生物菌落总数的变化规律可以推测，105 ℃杀菌4 ℃贮存卤蛋的保质期最长。因此，105 ℃中温杀菌结合4 ℃贮藏可作为生产高营养水平和长保质期卤蛋的一项较好的应用技术。