胡家达，吴海智， 薛昌安， 顾紫薇， 王若茜， 潘江山， 高永恒， 刘 亚，方富贵， 张运海， 丁建平， 李运生

(1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036； 2.安徽省畜牧技术推广总站，安徽合肥 230001)

精液冷冻保存技术可提高优秀种公畜的利用效率，加快品种改良步伐，便于精液长途运输，降低疾病传播风险。但不同物种间精子的冷冻保存效果仍有很大差异，这主要与精子的大小、性状、蛋白和脂质成分有关。因此，冷冻保存技术和精液稀释液是影响精液冷冻保存的关键因素。国外对山羊精液冷冻保存技术的研究始于20世纪。我国开展山羊冷冻保存研究较晚，至目前为止山羊精液冷冻保存效率仍普遍偏低，不同冷冻方法之间冻存效果差异较大，这限制了我国山羊冻精人工授精的应用和推广。

卵黄是精液冷冻最常用的保护剂，其广泛用于牛、羊等精子冷冻保护液。然而，卵黄也存在较多缺陷，其中，卵黄中含有较多微生物，可产生内毒素污染精液，降低精子的受精能力，增加疾病传播的风险。同时，精液中含有副性腺分泌的卵黄凝固酶(EYCE)，它与卵黄作用，对精子有毒性。因此，利用化学限定性培养基替代卵黄是近年的研究热点。大豆卵磷脂(SL)含有丰富的低密度脂蛋白(LDL)，可在精子冷冻过程中保护精子膜免受低温损伤。目前，研究表明，SL可作为卵黄替代用于牛、绵羊和山羊精子冷冻保存。磷脂酰胆碱属于卵磷脂的一种，是构成细胞膜的主要成分，其在生物膜之间通过磷脂酰胆碱转运蛋白(PTCP)转运。因此，磷脂酰胆碱是一种潜在的精液冷冻保护剂。目前尚未见应用于磷脂酰胆碱作为保护剂冻存山羊精液的报道。

胆固醇影响脂质链的排列，通过磷脂碳氢链稳定膜结构，避免膜状态发生变化。精子冷冻过程中胆固醇的大量丧失是膜状态转变的前提。Purdy等向公牛的冻精稀释液添加含有胆固醇的环糊精，解冻后提高了精子活力。研究表明，在兔和山羊精液稀释液中分别添加胆固醇均可显著提高精子活力。在山羊精液冷冻稀释液中添加含有胆固醇的环糊精，解冻后的精子活力显著高于对照组。

目前，仍需要优化在山羊精液冷冻保存中胆固醇和磷脂的添加浓度，且未见胆固醇和磷脂酰胆碱2种物质联合的报道。本试验通过对精子冻融前后膜质成分的检测，研究在稀释液中添加相应比例的胆固醇和磷脂酰胆碱，解冻后检测精子运动参数、质膜完整率和顶体完整率，评估其在山羊精液冷冻保存中的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验选取228只无生殖器官疾病、健康的安徽白山羊。

1.2 主要试剂

胆固醇、Tris、果糖、柠檬酸和甘油，均购于北京索莱宝科技有限公司；磷脂酰胆碱，来自Sigma公司；鸡蛋，购自农贸市场。

1.3 精液采集和稀释

假阴道法采集精液，感观检查合格，活力大于0.9时用于后续试验。将采得所有合格精液进行混合，测定混精密度。采用37 ℃基础稀释液(Tris 3.07 g/100 mL、柠檬酸 1.64 g/100 mL、果糖 1.26 g/100 mL)将精液稀释至4.8×10个/mL，待精液在5 ℃冰箱中缓慢降温平衡后，再用含10%甘油的稀释液将精液再稀释1倍，使得精液的终浓度为2.4×10个/mL。

1.4 精液的冷冻与解冻

在距离液氮面上方4 cm处将稀释后的精液在氟板上进行滴冻，每粒约50 μL。预冷10 min后将冻精颗粒浸入液氮保存。从液氮中取1粒冻精颗粒迅速置于预热好的离心管中，在37 ℃水浴中快速解冻30 s，取出室温下轻轻摇晃至颗粒完全融化。

1.5 精子膜脂质成分检测

参照倪利平的方法，采用甲醇-三氯甲烷混合液抽提精子脂质，4 ℃保存待测。采用总胆固醇试剂盒酶比色法，按试剂盒说明测定样品中总胆固醇含量。配制消化液、磷标准液和显色液等溶液，每个样品设1次重复，采用紫外-可见-近红外分光光度计测定各样品的浓度。

1.6 精子评估

1.6.1 精子运动参数 采用精子分析仪(SCA型，西班牙Microptic公司)测定精子活力(Motility)、曲线速率(VCL)、直线速率(VSL)、平均路径速度(VAP)、线性度(LIN)、摆动幅度(ALH)、摆动性(WOB)、笔直度(STR)和鞭打频率(BCF)等运动参数，随机选择3个视野，每个视野使用计算机软件分析5次，取15个结果的平均值作为样品最终结果。

1.6.2 质膜完整率检测 采用低渗透肿胀试验(HOST)检测质膜完整性。取25 μL精液添加至200 μL低渗液中，混合均匀，38.5 ℃下孵育45 min，再添加300 μL 2%戊二醛。取10 μL混合液于载玻片上，并在400倍光学显微镜下进行检测，随机从几个不同视野中，计数200个精子，精子尾部不弯曲表明精子质膜不完整，计算精子质膜的完整率。

1.6.3 顶体完整率检测 采用姬姆萨染色法检测精子顶体完整率。解冻后的精液抹片风干后，采用1 mL 甲醛液固定15 min冲洗干净，采用2 mL姬姆萨染液染色90 min。水洗风干后，在1 000倍油镜下镜检。计数200个精子，顶体严重膨胀或顶体脱落为顶体异常精子，计算精子顶体的完整率。

1.7 人工授精

在1.5 mL 离心管中加入0.2 mL 2.9%柠檬酸钠溶液，37 ℃水浴预热后，取4粒冻精投入离心管中，在37 ℃水浴30 s后取出，待室温完全融化后，将精液输入发情母羊子宫颈内。间隔12 h输精2次。

1.8 试验设计

1.8.1 冷冻对精子膜脂含量的影响 使用基础稀释液稀释精液，并检测精子冻融前后膜上胆固醇和磷脂含量变化。

1.8.2 不同浓度的胆固醇稀释液对冻精的影响 将混精分成5等份，分别用含1.0、2.5、5.0、 10.0 g/L 胆固醇或15%卵黄的基础稀释液稀释、冷冻，分别标为C1、C2.5、C5、C10、EY组。解冻后检测各组精子的运动参数、顶体完整率和质膜完整率。

1.8.3 磷脂酰胆碱稀释液对冻精的影响 将混精分成5等份，分别用含10、15、20、25 g/L的磷脂酰胆碱或15%卵黄的基础稀释液稀释、冷冻，标为P10、P15、P20、P25、EY组。解冻后检测各组精子的运动参数、顶体完整率和质膜完整率。

1.8.4 不同浓度的磷脂酰胆碱-胆固醇混合稀释液对冻精的影响 将混精分成5等份，分别用P19+C1(基础液+19 g/L磷脂酰胆碱+1 g/L胆固醇)、P18+C2(基础液+18 g/L磷脂酰胆碱+2 g/L胆固醇)、P16+C4组(基础液+16 g/L磷脂酰胆碱+4 g/L 胆固醇)、P14+C6(基础液+14 g/L磷脂酰胆碱+6 g/L胆固醇)和卵黄稀释液稀释、冷冻。解冻后检测各组精子的运动参数、顶体完整率和质膜完整率。

1.8.5 磷脂酰胆碱-胆固醇稀释液对精子膜脂含量的影响 将混精分成5等份，分别使用P19+C1、P18+C2、P16+C4、P14+C6和EY这5种稀释液稀释，比较各组冻融前后精子膜上胆固醇、磷脂的含量变化。

1.8.6 人工授精 选取224只正常发情的母羊，分别使用卵黄和P16+C4稀释液制作的颗粒冻精用于山羊输精，于输精后20 d，利用试情公羊连续试情48 h，统计不返情率，进而统计产羔率等相关指标。

1.9 统计分析

试验重复6次，试验数据使用SPSS 26.0软件进行处理，所得的试验结果采用“平均值±标准差”表示，使用Graph Pad Prism 9.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 冷冻对精子膜卵磷脂和胆固醇含量的影响

由图1可知，经冻-融处理后，山羊精子磷脂和胆固醇含量均显著降低(<0.05)。

2.2 不同浓度的胆固醇稀释液对山羊精液冷冻保存的影响

由图2可知，C2.5组、C5组和C10组的质膜完整率与卵黄组无显著差异(>0.05)，而C1组质膜完整率显著低于卵黄组(<0.05)。C1组的顶体完整率均显著低于其他各组(<0.05)。

由表1可知，胆固醇组解冻后的精子活力、VCL、VAP显著低于EY组(<0.05)，C1组和C2.5组的VSL显著低于EY组(<0.05)。胆固醇组解冻后的精子、LIN、笔直度(STR)、摆动性(WOB)、摆动幅度(ALH)和鞭打频率(BCF)与卵黄组无显著差异(>0.05)。

表1 胆固醇对山羊冻精活力及运动参数的影响

2.3 不同浓度的磷脂酰胆碱稀释液对山羊精液冷冻保存的影响

由图3可知，P20组质膜完整率与EY组差异不显著(>0.05)，P15组和P20组的顶体完整率与EY组差异不显著(>0.05)。P25组的质膜完整率和顶体完整率显著低于EY组(<0.05)，P15组的质膜完整率显著高于EY组(<0.05)，P10组的顶体完整率显著高于EY组(<0.05)。

由表2可知，P15组解冻活力及其他运动参数与EY组差异不显著(>0.05)，P10组、P20组和P25组的解冻活力均显著低于EY组(<0.05)，P25组的VCL和VAP显著低于EY组(<0.05)，而P25组的BCF显著高于EY组(<0.05)。

表2 磷脂酰胆碱稀释液对山羊冻精活力及运动参数的影响

2.4 不同浓度的磷脂酰胆碱、胆固醇混合稀释液对山羊精液冷冻保存的影响

由图4可知，P18+C2组、P16+C4组和P14+C6组的质膜完整率与EY组无显著差异(>0.05)，P19+C1组的质膜完整率显著低于EY组(<0.05)。P19+C1组、P18+C2组和P14+C6组的顶体完整率与EY组无显著差异(>0.05)，P16+C4组的顶体完整率显著高于EY组(<0.05)。

由表3可知，P16+C4组的精子活力、VCL和VAP显著高于卵黄组，VSL与卵黄组无显著差异(>0.05)。P19+C1组和P18+C2组的精子活力、VCL、VSL和VAP均与卵黄对照组无显著差异(>0.05)。

表3 磷脂酰胆碱和胆固醇混合稀释液对冻精活力及运动参数的影响

2.5 不同浓度磷脂酰胆碱、胆固醇混合稀释液对精子膜上卵磷脂和胆固醇含量的影响

由图5可知，P16+C4组冻精后精子膜上的磷脂含量显著高于P19+C1组、P18+C2组和P14+C6组(<0.05)。P18+C2组、P16+C4组和 P14+C6组冻精后精子膜上的胆固醇含量与卵黄组无显著差异(>0.05)，而P19+C1组冻精后精子膜上的胆固醇含量显著低于卵黄组(<0.05)。

2.6 P16+C4组和卵黄组稀释液对人工授精效果的比较

由表4可知，由于P16+C4添加组可显著改善精子冷冻前后胆固醇、磷脂浓度的损伤，同时提高精子顶体完整率和质膜完整率。本研究利用该方案获得的冻精进行人工授精配种试验，结果显示，P16+C4组的不返情率、受胎率、产仔率和公母比例均与EY组差异不显著(>0.05)。

表4 P16+C4组和卵黄组稀释液对山羊人工授精效果的比较

3 讨论与结论

卵黄作为使用最广泛的精液冷冻保护剂，存在较多不利因素，影响冻精保存效果。本研究目的是寻找一种可替代卵黄的限定化学成分精液冷冻稀释液。胆固醇可以调节膜脂的流动性，温度较高时可以降低膜的流动性，在低温下能促进脂肽链的运动，温度的降低不会导致膜流动性的减弱，因此胆固醇可改善低温下精子膜的流动性，提高冷冻精子的活力。本研究发现，适量浓度胆固醇添加到精液冷冻液中，解冻后精子的质膜完整率与卵黄组无显著差异，表明胆固醇对精子质膜具有较好地保护作用。这与前人在山羊精液冷冻保存的研究结论一致。但单独以胆固醇取代卵黄冷冻后精子的活力、运动参数和顶体完整率均低于卵黄组，说明单独添加胆固醇不能达到替代卵黄的效果。Barenholz研究表明，胆固醇抑制了膜上的Na/KATP泵，对精子的运动产生影响。当胆固醇浓度过高时，膜的流动性反而会显著降低，精子更易受到机械损伤。本试验发现当添加的胆固醇浓度由5 g/L增加至10 g/L时，解冻精子的活力反而下降。顶体损伤通常是由于形成了较大冰晶，损伤了精子的内在结构所导致。胆固醇组的顶体完整率较低的原因可能是胆固醇不能阻止大量冰晶的形成对顶体造成的损伤。

磷脂酰胆碱补充了精子在降温过程中丢失的膜磷脂，而且可以替换一些精子膜上的磷脂酰胆碱，减少膜受到损伤。高浓度的大豆卵磷脂会对精子产生毒性，主要会对膜完整性产生不利的影响。本试验中当磷脂酰胆碱添加量大于20 g/L时，造成膜损伤可能是由于磷脂酰胆碱浓度过高引起毒性反应。而添加10 g/L磷脂酰胆碱，可能由于浓度过低不能有效地保护精子。

本试验中，当同时添加16 g/L磷脂酰胆碱和 4 g/L 胆固醇获得了比卵黄更好的保存效果，冻精后精子活力、精子VCL、VSL均显著提高。通过脂质含量检测发现，P16+C4稀释液冻后精子质膜上的磷脂含量较卵黄组高，表明采用胆固醇和磷脂酰胆碱代替卵黄，能更好地避免精子膜上胆固醇与磷脂的流失，提高冻精保存的效果。Mutalik等在稀释液中按照一定比例(95 ∶5、90 ∶10、80 ∶20、70 ∶30)添加大豆卵磷脂和胆固醇，结果表明按照80 ∶20比例添加两种物质替代卵黄用于人的精子冷冻得到了较好的保存效果。另外精子膜完整性对精子在雌性的生殖道中行使功能也发挥着重要的作用，这可能也是P16+C4组的人工授精效果更好的原因。

本研究结果表明，单独用胆固醇或磷脂酰胆碱替代卵黄，冻精效果低于卵黄组，当添加16 g/L磷脂酰胆碱和4 g/L胆固醇替代卵黄时解冻效率高于卵黄组，达到了在山羊精液冷冻保存中替代卵黄效果。