吕 冬，肖素芸，罗才琴，李起慧，曲 媛,2,3，崔秀明,2,3,4

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.云南省三七资源可持续利用重点实验室，云南 昆明 650500；3.国家中药材产业技术体系昆明综合试验站，云南 昆明 650500；4.云南省三七研究院，云南 昆明 650500)

三七 [Panax notoginseng(Burk) F.H.Chen]为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物，是中国名贵中药材，主要产地为云南文山地区，现主要用于心脑血管疾病的防治。鲜三七属于季节性药材，受潮湿环境的影响易发霉变质，所以主要以干品保存入药[1-3]。

三七的传统干燥工艺主要为烤房烘烤和自然晾晒，虽操作简便，但过高的烘烤温度会降低三七中有效成分的含量、影响口感和内部结构且质量标准难以控制[4]。近年来，随着中药材干燥技术的改进，冷冻干燥法和热风干燥法已成为三七干燥的主要方法。已有研究报道：与传统晾晒相比，热风干燥法采用不同温度烘干三七鲜品，随着温度的升高，三七素和总黄酮含量呈下降趋势；烘干温度为50 ℃时，皂苷成分、还原糖和总糖含量最高，烘干温度为60 ℃时含量较低[5-6]。冷冻干燥法可提高皂苷、三七素、还原糖和总糖含量，但因设备昂贵、费时长，导致耗能大、成本偏高[7]。与普通三七粉相比，冻干三七粉的皂苷类成分虽变化不大，但可提高凝血时间，降低耳肿胀率[8]。然而，不同干燥方式是否会影响除皂苷外的其他成分进而影响药效还鲜有报道。

鲜三七快干粉是一种干燥与成粉一体化的三七新型饮片，由昆明理工大学、云南崔三七药业股份有限公司和云南七丹药业股份有限公司共同开发。为了评价新型饮片的质量及生物活性，寻找内在成分的潜在药效活性，本研究采用基于功效成分—药效评价的方法，对冻干三七粉和鲜三七快干粉2种新型饮片进行评价，并与传统饮片(热风干燥粉)进行比较，以期为三七新型饮片的标准制订提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料采集及处理

试验用鲜三七药材由云南七丹药业股份有限公司提供，经昆明理工大学杨野教授鉴定为五加科人参属植物三七的根，为人工种植 3年生药材原料。鲜三七经洗净和分离主根后随机分为3份，每份 2 kg，3 mm切片后分别进行热风干燥、冷冻干燥和鲜三七快速干燥处理。主要工艺流程：热风干燥法为50 ℃烘干36 h；冷冻干燥法为35 ℃预冻5 h，15 ℃程序升温2 h，40 ℃干燥17 h；鲜三七快速干燥法为在密闭容器中，利用高速旋转的叶轮将三七破碎成匀浆状态，同时采用风机产生的热流进行循环干燥。3种干燥饮片均干燥至含水量2%以下，打粉后过100目筛，每组试验设置3个重复。

1.2 试验药品及仪器

三七皂苷R1(批号：wkq20022804)、人参皂苷Rg1(批号：wkq20022711)、人参皂苷Re (批号：wkq20051806)、人参皂苷Rb1(批号：wkq2001007)和人参皂苷Rd (批号：wkq20051506)均购自四川维克奇生物科技有限公司；槲皮素 (批号：C01J10Y91727)、没食子酸 (批号：C1309C72105)标准品和阿司匹林 (批号：Y06N8047275)均购自上海源叶生物科技有限公司；活化部分凝血酶时间 (批号：B202009A)、凝血酶原时间 (批号：A202009A)和凝血酶时间 (批号：B202005B)试剂盒均购自赛奥生物科技(青岛)有限公司；维生素K (批号：C31A4602)购自西亚科技；罗通定(批号：200301)购自四川迪菲特药业有限公司。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

主要仪器包括：Agilent 1260液相色谱仪 (安捷伦科技有限公司)、XN06-IV凝血仪 (武汉景川诊断技术股份有限公司)、SCIENT2-10ND冷冻干燥机 (宁波新芝生物科技有限公司)、DGG-9123AD电热鼓风干燥箱 (上海一恒科技有限公司)、K9840自动凯氏定氮仪 (济南海能仪器股份有限公司)、N-1100旋转蒸发仪 (上海爱朗仪器有限公司)、UV-2600紫外分光光度计 (岛津科技有限公司)和KQ5200E超声波清洗仪 (昆山超声有限公司)。

1.3 成分指标测定及方法

1.3.1 三七5种单体皂苷含量测定

(1)色谱条件

色谱柱：上海谱宁 Pntulips RSZG-C18Plus柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)和纯净水(B)；梯度洗脱：0～20 min：20% A，20～45 min：46% A，45～55 min：55% A，55～60 min：55% A；检测波长：203 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流速：1 mL/min。用于测定的对照品溶液和三七样品溶液的HPLC色谱图见图1。

图1 对照品溶液(a)和三七样品提取物(b)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference solution (a) and Panax notoginseng sample extract (b)

(2)供试品溶液制备

称取各供试三七样品0.3 g，加入甲醇溶液超声提取30 min，离心后滤渣重复提取1次，合并2次提取液定容至25 mL，过0.45 μm滤膜得到供试液。

(3)线性关系考察

精密称定适量三七皂苷R1以及人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd标准品以甲醇溶解稀释成不同质量浓度的溶液，经203 nm波长下检测峰面积，以质量浓度 (x)为横坐标、峰面积 (y)为纵坐标绘制标准曲线。R1：y=2 491.400x+16.508 (R2=0.999 9)；Rg1：y=3 212.500x-2.404 (R2=0.999 8)；Re：y=3 371.500x+5.425 (R2=0.999 9)；Rb1：y=2 249.800x-3.767 (R2=0.999 9)；Rd：y=3 382.500x-1.029(R2=0.999 9)。结果表明在0.025～0.400 mg/mL范围内各皂苷与峰面积线性关系良好。将样品峰面积带入回归方程中，即可得样品中各皂苷成分含量。

1.3.2 三七总多糖含量测定

(1)供试品溶液制备

称取各供试三七样品2 g，按料液比1∶20(g∶mL)加入超纯水超声30 min，离心取上清；取滤渣加等比例水，75 ℃水浴1 h，重复2次；3 500 r/min离心10 min，合并上清液，静置抽滤。上清液除蛋白及冷冻干燥方法参考LIU等[9]的研究。

(2)线性关系考察

精密称取适量葡萄糖，加水稀释至不同质量浓度并置于25 mL比色管中，依次加入6%苯酚溶液1 mL和浓硫酸5 mL，混匀，放置至室温，在液面厚度 1 cm、波长490 nm条件下测定吸光度。以质量浓度(x)为横坐标、吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y=12.800x+0.094(R2=0.999 0)。结果表明在0.012 5～0.075 0 mg/mL范围内多糖与吸光度线性关系良好。

(3)总多糖含量测定

采用苯酚—硫酸法[10]测定。

1.3.3 三七总黄酮和总酚含量测定

(1)供试品溶液制备

称取各供试三七样品0.4 g，分别加入70%乙醇，超声15 min，离心取上清，重复提取3次，合并上清液，加70%乙醇定容至25 mL得到供试品溶液。

(2)线性关系考察

精密称取适量槲皮素和没食子酸对照品，加入乙醇稀释成不同质量浓度，分别在波长256和273 nm下测定其吸光度，以质量浓度(x)为横坐标、吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线，得总黄酮回归方程y=25.900x+0.054 (R2=0.999 3)、总酚回归方程y=33.600x+0.032 (R2=0.999 7)。结果表明在2～12 μg/mL范围内总黄酮和总酚酸与吸光度线性关系良好。

(3)总黄酮和总酚含量测定

采用紫外分光光度法[11]测定。

1.3.4 三七总蛋白提取及含量测定

参考硫酸铵沉淀法[12]提取三七总蛋白，采用凯氏定氮法[13]测定样品总蛋白含量。

1.4 各成分的方法学考察

皂苷及非皂苷成分的方法学考察参考《中华人民共和国药典：四部》[13]。

1.5 药理活性试验

1.5.1 试验动物分组及处理

SPF级昆明小鼠共284只，18～20 g，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK (湘) 2019-0004。

选取供试小鼠88只，雌雄各半，随机分为11组，每组8只。耳肿胀抗炎试验和醋酸扭体镇痛试验的3种干燥粉给药组分为高(1.0 g/kg)、中(0.50 g/kg)、低(0.25 g/kg)剂量组，止血试验的3种干燥粉给药组分为高(1.5 g/kg)、中(1.0 g/kg)、低(0.5 g/kg)剂量组；耳肿胀抗炎试验、醋酸扭体镇痛试验和止血试验的空白组均灌胃生理盐水(0.2 mL/20 g)，阳性对照组分别灌胃阿司匹林(0.5 g/kg)、罗通定(0.3 g/kg)和维生素K (0.5 g/kg)，连续给药7 d。

1.5.2 验证试验

(1) 体外抗凝血试验

选取供试小鼠20只，眼球取血，离心取上层血浆，称取各供试三七样品5 g，按料液比1∶20(g∶mL)加入70%甲醇超声提取，提取液旋蒸干燥得到提取物，生理盐水复溶提取物，分别制备50、25、10、5和1 mg/mL的梯度溶液，按照试剂盒说明书要求检测活化部分凝血酶时间(activated partial thrombin time，APTT)、凝血酶时间(thrombin time，TT)和凝血酶原时间(prothrombin time，PT)。空白组以生理盐水、阳性对照组以0.05和1.00 mg/mL肝素钠溶液测定各试剂盒的抗凝血时间。

(2) 耳肿胀抗炎试验

末次给药1 h后，使用50 μL二甲苯涂抹小鼠右耳，引发炎症，15 min后脱颈处死，延耳轮廓将双耳用打孔器在同一标记部位剪下，精密称量，计算肿胀率和肿胀抑制率：

肿胀率=(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量×100%；

抑制率=(空白组肿胀率-给药组肿胀率)/空白组肿胀率×100%。

(3) 醋酸扭体镇痛试验

末次给药1 h后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液，每只剂量为0.2 mL/20 g，记录15 min内各组小鼠扭体次数和镇痛潜伏时间。扭体判断依据为腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起。

(4) 止血和凝血活性试验

末次给药1 h后，将不同分组的小鼠尾末端0.5 cm处剪断，每30 s用滤纸擦干，直至出血停止，记录止血时间(bleeding time，BT)。末次给药1 h后，按照给药顺序用毛细管进行小鼠眼眶静脉取血，将毛细管平放，每隔15 s折断一小块，直至出现血凝丝，计算从采血成功到出现血凝丝的时间即为凝血时间(clotting time，CT)。

1.6 药效验证试验

1.6.1 体外抗凝血试验

三七总多糖及三七总蛋白提取操作方法同1.3.2和1.3.4节，试验分组及APTT和PT试剂盒检测同1.5.2节。

1.6.2 醋酸扭体镇痛试验

选取供试小鼠24只，雌雄各半，随机分为4组，给药组分为三七总多糖组和三七总蛋白组，均以1.0 g/kg灌胃给药7 d，空白组和阳性给药组给药剂量同1.5.1节，试验方法同1.5.2节(3)。

1.7 数据统计与分析

数据用“平均值±标准差”表示；采用SPSS 19.0软件进行显著性分析和双变量相关性分析；相同指标不同处理进行Duncan’s多重分析；采用Graph Prism 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 3种饮片功效成分含量

2.1.1 皂苷和非皂苷成分方法学考察结果

精密度试验三七皂苷R1以及人参皂苷Rg1、Re、Rb1和 Rd 的相对标准偏差 (RSD) 分别为 1.10%、1.80%、1.76%、1.83%和1.10%；重复性试验各皂苷RSD分别为1.90%、2.11%、2.43%、2.70%和2.98%；稳定性试验各皂苷在0、2、4、6、8、12和24 h的RSD分别为2.22%、2.71%、2.12%、2.93%和1.22%。加样回收率试验各皂苷平均加样回收率分别为100.00%、99.45%、101.11%、98.76%和100.66%，RSD分别为1.88%、1.70%、1.67%、1.91%和1.98%。

精密度试验总多糖、总黄酮和总酚RSD分别为1.80%、0.78%和1.38%；重复性试验各成分RSD分别为1.66%、1.19%和1.33%；稳定性试验各成分在0、2、4、6、8、12和24 h的RSD分别为2.48%、1.68%和2.98%。加样回收率试验总多糖平均加样回收率为97.77%，RSD为2.27%；总黄酮平均加样回收率为98.25%，RSD为1.47%；总酚平均加样回收率为99.33%，RSD为1.39%。

2.1.2 3种饮片5种皂苷含量比较

由表1可知：与热风干燥粉相比，鲜三七快干粉和冻干三七粉的5种皂苷总量小幅度提高，5种皂苷总量表现为冻干三七粉>鲜三七快干粉>热风干燥粉。与热风干燥粉相比，鲜三七快干粉的Rg1和Rb1含量分别显著提高4.02%和4.48%(P<0.05)，R1含量显著降低10.45% (P<0.05)；与热风干燥粉相比，冻干三七粉的5种皂苷总量以及Rg1和Rb1含量分别显著提高10.03%、16.33%和12.17% (P<0.05)，R1含量显著降低11.19% (P<0.05)。冻干三七粉的Re含量虽高于热风干燥粉和鲜三七快干粉，但无显著差异。

表1 3种饮片单体皂苷的含量Tab.1 Content of three kinds of single saponins in decoction pieces %

2.1.3 3种饮片的非皂苷成分含量

由表2可知：不同干燥方式引起的非皂苷含量变化差异较大，冻干三七粉除总蛋白含量显著高于热风干燥粉和鲜三七快干粉外 (P<0.05)，其总黄酮和总酚含量均低于其他2种干燥方式。鲜三七快干粉的总多糖含量显著高于其他2种干燥方式 (P<0.05)。与热风干燥粉相比，鲜三七快干粉的总多糖和总酚含量分别显著提高278.40%和29.33% (P<0.05)，冻干三七粉总黄酮含量显著降低8.52% (P<0.05)、总多糖和总蛋白含量分别显著提高49.76%和22.85% (P<0.05)。

表2 3种饮片的非皂苷成分含量Tab.2 Contents of non-saponin components in three decoction pieces mg/g

2.2 3种饮片的药理活性差异

2.2.1 体外抗凝血试验

由图2可知：抗凝血时间与样品质量浓度之间呈依赖性关系。当三七饮片质量浓度低于25 mg/mL时，凝血时间逐渐接近空白组，抗凝效果进入平台期。在50 mg/mL剂量组中，冻干三七粉对延长凝血酶原时间(PT)的效果最好(P<0.05)；鲜三七快干粉对延长部分凝血酶时间(APTT)的效果最好(P<0.05)，对延长凝血酶时间(TT)的效果最差(P<0.05)。

图2 不同三七饮片的抗凝活性Fig.2 Anticoagulant activity of different P.notoginseng pieces

2.2.2 耳肿胀抗炎试验

由图3可知：与空白组相比，阳性组与各给药组均能降低或显著降低耳肿胀率并显著提高肿胀抑制率。在1.00 g/kg剂量组中，与热风干燥粉组相比，冻干三七粉组的耳肿胀率显著降低(P<0.05)，鲜三七快干粉组的耳肿胀率虽下降，但无显著性差异；鲜三七快干粉和冻干三七粉组的肿胀抑制率显著提高(P<0.05)，但二者之间无显著差异。

图3 不同三七饮片的抗炎活性Fig.3 Anti-inflammatory activity of different P.notoginseng pieces

2.2.3 醋酸扭体镇痛试验

由图4可知：与空白组相比，除冻干三七粉低剂量组外，阳性组与其他给药组均能显著降低扭体次数并显著提高镇痛潜伏时间(P<0.05)。在1.00 g/kg剂量组中，鲜三七快干粉组的扭体次数显著少于冻干三七粉和热风干燥粉组(P<0.05)，但冻干三七粉可显著延长镇痛潜伏时间(P<0.05)。在0.50 g/kg剂量组中，鲜三七快干粉组的镇痛潜伏时间显著长于热风干燥粉组(P<0.05)。

图4 不同三七饮片的镇痛活性Fig.4 Analgesic activity of different P.notoginseng pieces

2.2.4 止血活性试验

由图5可知：与空白组相比，除冻干三七粉低剂量组外，阳性对照组与其他给药组均可降低或显著降低凝血时间和止血时间。在1.5 g/kg剂量组中，三七饮片的凝血时间表现为热风干燥粉>鲜三七快干粉>冻干三七粉，止血时间表现为热风干燥粉>冻干三七粉>鲜三七快干粉。

图5 不同三七饮片的止血活性Fig.5 Hemostatic activity of different P.notoginseng pieces

2.3 成分—药效相关性分析

由表3可知：抗凝血活性中，ATPP与总多糖含量的相关系数大于0.9；PT与Rg1含量呈极显著正相关(P<0.01)，与Rb1含量呈显著正相关(P<0.05)；TT与Re呈显著正相关(P<0.05)，与总酚含量呈显著负相关(P<0.05)。镇痛活性中，扭体次数与总多糖含量呈显著负相关(P<0.05)；潜伏时间与5种皂苷总量、Rg1含量和总蛋白含量呈显著或极显著正相关(P<0.05或P<0.01)。抗炎、止血活性与各成分之间相关性不显著。

表3 不同三七饮片化学成分和抗凝血、镇痛活性的相关性分析Tab.3 Correlation analysis of chemical components and anticoagulant and analgesic activities of different P.notoginseng pieces

2.4 药效验证试验

2.4.1 体外抗凝血试验

由图6可知：与空白组相比，三七总多糖各剂量组可显著延长APTT、三七总蛋白5和10 mg/mL剂量组可显著延长PT (P<0.05)，并呈剂量依赖关系。

图6 三七总多糖 (TPo) 与总蛋白 (TPr) 的抗凝活性Fig.6 Anticoagulant activity of P.notoginseng total polysaccharides (TPo) and total protein (TPr)

2.4.2 醋酸扭体镇痛试验

由图7可知：与空白组相比，三七总多糖与总蛋白均可显著降低扭体次数(P<0.05)，且三七总多糖的镇痛活性显著优于三七总蛋白(P<0.05)；在延长镇痛潜伏时间中，与空白组相比，三七总多糖与总蛋白潜伏时间小幅度提高，但无显著差异。

图7 三七总多糖 (TPo) 与总蛋白 (TPr) 的镇痛活性Fig.7 Analgesic activity of P.notoginseng total polysaccharide (TPo) and total protein (TPr)

3 讨论

三七产业化发展存在以下主要问题：(1) 三七传统干燥工艺难以把控质量标准，如自然晾晒法处理后的三七农残及重金属含量易超标，受阴雨天气影响较大，易发霉变质；(2) 三七新型饮片开发具有生产规模大、成本低、耗时短和操作简单等特点，但冷冻干燥技术设备昂贵、耗能大、投入高，限制了冻干三七的产业化发展[14]；(3) 2020年版中国药典[15]中，三七药材及饮片成分的质量标准仅包括对皂苷类成分的要求，对非皂苷成分无要求，然而皂苷类成分可能难以反映三七饮片质量的全貌，导致市场上的三七饮片质量不均一。

本研究中的快速干燥技术可直接将湿料在3 min内加工成干料，是一种干燥与成粉一体化的新型中药材加工技术，与自然晾晒和冷冻干燥技术相比具有成本低、节能减排、易于大规模生产和便于质量标准把控等优点。此外，本研究中3种干燥方式引起的皂苷类成分变化较小，但对非皂苷成分影响较大。鲜三七快干粉的总多糖和总酚含量显著高于热风干燥粉；与热风干燥法相比，冷冻干燥法对热敏成分影响较小，可减少三七皂苷和蛋白的流失，但皂苷含量只是小幅度提升，远不如总多糖和总蛋白变化量高。西洋参[16]、香椿[17]和仿刺参[18]同样采用冷冻干燥法以减少皂苷和蛋白的流失，但总皂苷含量变化不大。XIONG等[19]通过不同温度炮制三七发现温度对皂苷影响较大，高温可促进皂苷的流失和转变。本研究发现：热风干燥粉的R1含量高于鲜三七快干粉和冻干三七粉，但除Re外的其他单体皂苷成分含量则少于后2种干燥方式，可见，在热风干燥工艺环境下发生了部分皂苷的转变。

本研究的药理试验均设置4个剂量组，最高剂量组为1.50 g/kg，最低剂量组为0.25 g/kg，但在耳肿胀抗炎试验和醋酸扭体镇痛试验中发现：1.50 g/kg给药组与其他剂量组不存在量效关系，故将1.00 g/kg设为高剂量组。不同处理方式引起的成分变化直接影响药效。李志强等[20]通过研究不同生长年限霍山石斛对小鼠急性肝损伤的保护作用发现：除单体成分石斛酚外，总多糖成分在急性肝损伤中起主导作用。本研究发现：镇痛潜伏时间与Rg1含量极显著正相关、与5种皂苷总含量显著正相关，可见，Rg1在镇痛活性中起主导作用；延长TT与5种皂苷总量无相关性，但与Re含量显著正相关，所以Re在延长TT中起主导作用；延长PT与5种皂苷总量无相关性，但分别与Rg1和Rb1含量呈极显著和显著正相关，所以Rg1和Rb1在延长PT中起主导作用。朱再标等[21]和杨金凤等[22]通过比较不同光强和水分处理下垂盆草的保肝活性发现：保肝活性与异鼠李素正相关，其机制可能与抗氧化有关；总黄酮和总酚含量与细胞抗氧化系数虽呈正相关，但无显著性差异。随即通过研究验证垂盆草中的总黄酮可通过抗氧化活性降低乙酰氨基酚诱导的L02肝细胞损伤，并可通过降低异鼠李素毒性起到辅助作用[23]。本研究中，三七总多糖含量与ATPP正相关、与扭体次数显著负相关，推测三七多糖除免疫调节和抗肿瘤[24]外可能存在镇痛和抗凝功效；同样地，三七总蛋白含量与PT正相关、与镇痛潜伏时间显著正相关，也可能存在潜在抗凝与镇痛活性。经体外抗凝和体内醋酸扭体验证试验发现：总多糖和总蛋白可分别延长APTT和PT，降低醋酸导致的扭体次数，体现抗凝和镇痛活性，因此，在3种干燥饮片引起的药效差异中，不仅仅是皂苷类成分起主要作用，非皂苷成分也起着很重要的角色。

4 结论

鲜三七快速干燥粉是一种“鲜药材—饮片”的中药材加工一体化新型饮片，与热风干燥粉相比，其皂苷类成分与非皂苷成分均有不同程度的提升。成分—药效相关性分析和药效验证试验中发现了皂苷类成分、三七总多糖和总蛋白的抗凝和镇痛活性。因此，除皂苷成分外，非皂苷成分也可作为评价饮片品质的指标，为三七新型饮片的加工提供科学依据。