张赛男, 陈菲菲, 李 琳, 赵 莎, 王小康, 朱国强, 朱晓芳

(1. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225001; 2. 扬州大学临床医学院 皮肤科, 江苏 扬州, 225001;3. 大连医科大学, 辽宁 大连, 116044; 4. 扬州大学兽医学院, 江苏 扬州, 225009)

银屑病是一种由遗传、环境共同作用诱发的免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病，其中寻常型银屑病是最常见的亚型，典型临床表现为多发的鳞屑性红斑，边界清楚，周围可有红晕。银屑病的发病机制研究[1]发现，炎症性的细胞死亡在银屑病的发生、发展中起重要作用。细胞焦亡是由Gasdermin家族蛋白(GSDMs)介导的炎症性的细胞程序性死亡，其发生过程中往往伴随着炎症因子表达的增多和机体炎症水平的上调[2-3]。GSDMD是一种细胞膜穿孔蛋白，是焦亡的执行蛋白，被炎性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)切割为N端和C端，其N端结构域可引发胞质膜穿孔，细胞肿胀、裂解、死亡，导致白细胞介素(IL)-1β和IL-18等炎症因子的释放，诱导炎症级联放大反应。然而GSDMD能够介导IL-1β的释放，却不能介导IL-1β的成熟。经典炎症小体中的Caspase-1是IL-1β和IL-18的激活酶，可介导两者的活化[4-6, 11]。本研究检测进行期寻常型银屑病患者血清及皮损中焦亡关键因子Caspase-1的表达和银屑病皮损中GSDMD、Gasdermin家族蛋白D-N端(GSDMD-N)表达情况，进一步探讨细胞焦亡在银屑病发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象及样本采集: 选取2020年4月—2021年10月在苏北人民医院皮肤科被诊断为进行期寻常型银屑病的20～50岁的30例患者为研究对象，并将其纳入银屑病组(PSO组，排除伴有其他疾病以及近期使用强效激素或免疫抑制剂治疗的患者)，其中仅有20例患者同意进行皮肤活检获取皮损，所有患者均同意收集血清。收集同时期在苏北人民医院体检中心体检的30例健康者的血清和整形外科20例健康求美者的皮肤组织(皮损)，并纳入健康对照组(CON组)。研究对象均已签署知情同意书，本研究已通过苏北人民医院伦理委员会审核。

1.1.2 样品处理: 将收集的血清置于-80 ℃保存, 1个月内进行检测。将2组收集的皮损分为2份, 1份置于10%中性福尔马林4 ℃暂存, 1周内进行石蜡包埋、常温保存，另1份立即液氮速冻并置于-80 ℃保存。

1.1.3 试剂及仪器: TRIzol Universal总RNA提取试剂及逆转录试剂盒(北京TIANGEN)、聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒(南京Vazyme)、Caspase-1酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉Elabscience)、Caspase-1抗体(英国Abcam)、二抗(常州Affinity)、GSDMD抗体(美国Proteintech)、GSDMD-N(美国Cell Signaling Technology)、DAB试剂盒(北京中杉金桥)、二步法试剂盒(北京中杉金桥)、苏木素(Wellbio)、光学显微镜(motic)。

1.2 方法

采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测人血清Caspase-1mRNA表达情况。将血清室温放至融化, 3 000转/min离心1 min, 抽取上层血清，采用RNA提取试剂盒提取血清中的总RNA, 用反转录试剂盒进行反转录，实验操作完全按照说明书进行。在冰上配制PCR反应液后进行qRT-PCR扩增反应: 预变性95 ℃ 30 s, 进行PCR循环(95 ℃、5 s, 60 ℃、40 s), 重复40个循环。引物及内参序列见表1, 采用2-△△Ct公式进行计算，分析Caspase-1mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物设计序列

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测人血清Caspase-1表达水平。将血清室温放至融化, 3 000转/min离心1 min, 抽取上层血清，严格按照Caspase-1酶联免疫吸附测定试剂盒说明书检测PSO组及CON组血清中Caspase-1表达水平。

采用蛋白质印迹法(WB)检测皮肤组织中Caspase-1蛋白表达情况。将皮肤组织从-80 ℃冰箱取出后加入适量液氮于研钵中进行研磨，磨至粉末状后加入100∶1的Ripa裂解液和PMSF溶液预混液(每10 mg皮损中加入40 μL预混液)，冰上提取组织总蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度, 4∶ 1加入蛋白上样缓冲液(5×), 95 ℃恒温水浴锅中加热5 min, 收集上清，依次进行配胶、电泳、转膜、封闭、孵育一抗(4 ℃过夜)、孵育二抗(室温40 min)。采用化学发光法检测并用Image J软件分析。

采用免疫组织化学(IHC)染色法检测GSDMD、GSDMD-N表达情况。将石蜡包埋的皮肤组织脱蜡、水化、切片后热修复抗原，将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH值为6.0)中连续煮20 min后，冷却20 min后拿出，冷却至室温。加入1%高碘酸放置于室温10 min, 以灭活内源性酶。孵育一抗: 滴加适当稀释的一抗GSDMD(1∶ 50), GSDMD-N(1∶50), 4 ℃过夜。孵育二抗: 滴加50～100 μL二抗, 37 ℃孵育30 min, DAB显色，采用苏木素复染，各级乙醇(60%～100%)脱水。切片脱水后置于二甲苯中浸泡10 min, 重复2次，采用中性树胶封片，显微镜下观察。根据染色强度计分，以>50%细胞的染色情况计分，未染色为0分，浅黄色至黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。细胞染色阳性率: 显微镜下放大400倍情况下随机选取5个视野进行细胞计数，计算染色细胞的阳性率，取平均值。无阳性为0分, 1%～25%为1分, >25%～50%为2分, >50%～75%为3分, >75%为4分。根据细胞染色的深浅及染色率进行综合评分: 0分为阴性, 1～3分为弱阳性(+), 4～5分为阳性(), 6～7分为强阳性()。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 2组血清中Caspase-1 mRNA表达水平和Caspase-1蛋白表达水平

qRT-PCR结果显示, PSO组血清中Caspase-1mRNA表达水平高于CON组，差异有统计学意义(P<0.01)。ELISA检测结果表明, PSO组血清中Caspase-1蛋白表达水平高于CON组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 2组血清中Caspase-1 mRNA相对表达量和Caspase-1蛋白表达水平比较

2.2 2组皮损中Caspase-1、Pro-Caspase-1和Cleaved Caspase-1蛋白的表达水平

WB检测结果表明, PSO组皮损中的Pro-Caspase-1蛋白表达水平低于CON组, Cleaved Caspase-1蛋白表达水平高于CON组，差异有统计学意义(P<0.01); PSO组与CON组的Caspase-1蛋白总体表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见图1。

A: PSO组和对照组皮损的WB电泳图; B: 2组皮损中的Pro-Caspase-1蛋白含量; C: 2组皮损中的Cleaved-Caspase-1蛋白含量; D: 2组皮损中的Caspase-1总蛋白含量。与CON组比较, **P<0.01。图1 2组皮损中Caspase-1、Pro-Caspase-1和Cleaved Caspase-1蛋白表达水平

2.3 PSO组和CON组皮损中GSDMD、GSDMD-N蛋白表达情况

光镜下观察到黄色或棕黄色(深至褐色)的颗粒沉着。GSDMD的IHC结果提示, PSO组无阴性及弱阳性患者, 8例为阳性, 12例为强阳性; CON组无阴性, 2例为弱阳性, 15例为阳性, 3例为强阳性。PSO组表皮及真皮中GSDMD表达的阳性率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。GSDMD-N的IHC结果提示, PSO组无阴性, 4例为弱阳性, 13例为阳性, 3例为强阳性; CON组13例为阴性, 7例为弱阳性，无阳性及强阳性。PSO组的表皮及真皮中GSDMD-N表达的阳性率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01), 见图2。

A: 银屑病患者皮损的GSDMD染色结果(放大100倍); B: 银屑病患者皮损的GSDMD染色结果(放大400倍); C: 对照组皮肤组织的GSDMD染色结果(放大100倍); D: 对照组皮肤组织的GSDMD染色结果(放大400倍); E: 银屑病患者皮损的GSDMD-N染色结果(放大100倍); F: 银屑病患者皮损的GSDMD-N染色结果(放大400倍); G: 对照组皮肤组织的GSDMD-N染色结果(放大100倍); H: 对照组皮肤组织的GSDMD-N染色结果(放大400倍)。图2 银屑病患者及对照组皮肤组织中GSDMD、GSDMD-N的表达(免疫组织化学染色)

3 讨 论

银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性疾病，极易复发，严重影响患者身心健康，现已被认为是一种系统性疾病，其病因及发病机制复杂，尚未完全阐明[7]。研究[8]表明，细胞焦亡在银屑病的发病机制中发挥重要作用。细胞焦亡是由GSDM蛋白家族介导的依赖于炎性小体和半胱-天冬酶(Caspases)的炎症性程序死亡。GSDMD作为焦亡的执行蛋白，发挥作用需要炎性Caspases (Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11)及炎性小体的激活，激活后可导致细胞裂解死亡，同时释放细胞内的炎症因子及细胞内容物, Caspase-1也可介导IL-1β进一步的激活。因此, Caspase-1在GSDMD的激活阶段及GSDMD打孔完成后的炎症阶段都可发挥重要作用，说明GSDMD及Caspase-1可能与银屑病的发生、发展密切相关[5]。

Caspase-1是Caspase家族中被研究较多的一种炎症性Caspase, 在多种炎症性疾病中发挥作用，尤其对炎症因子IL-1β、IL-18和IL-37的释放有很大促进作用，这些炎症因子已被证明与银屑病的发生密切相关[9-10]。本研究结果表明，进行期寻常型银屑病患者皮损中Pro-Caspase-1蛋白水平低于对照组, Cleaved Caspase-1蛋白水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01), 而Caspase-1总体蛋白水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05), 表明进行期寻常型银屑病患者皮损中的Pro-Caspase-1被激活，参与了银屑病的发生和发展。JOHANSEN C等[11]研究结果表明，银屑病患者皮损内的Caspase-1mRNA表达水平高于对照组，皮损内的Caspase-1 蛋白表达水平高于对照组。SU F等[12]研究发现，银屑病患者皮损部位的Caspase-1的中间形态(即本研究中Cleaved Caspase-1)含量高于非皮损部位，差异有统计学意义(P<0.05), 但Pro-Caspase-1含量差异无统计学意义(P>0.05)。

本研究通过IHC染色的方法进一步验证了寻常型银屑病患者皮损中GSDMD和GSDMD-N蛋白量高于对照组，且GSDMD和GSDMD-N在皮损表皮和真皮中表达均增高，但以表皮增高为主，提示GSDMD可能参与寻常型银屑病的发生与发展。

虽然本研究显示了焦亡执行蛋白GSDMD和焦亡关键因子Caspase-1在寻常型银屑病患者体内表达明显增加，但银屑病患者皮损部位和非皮损部位Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N的表达是否存在差异以及银屑病患者血清中增加的Caspase-1是否为其活性形式尚未证实。此外，细胞焦亡机制复杂，本研究仅验证了寻常型银屑病患者Caspase-1和GSDMD的表达增加，还有更多的焦亡相关因子尚未检测，且银屑病发病机制十分复杂，细胞焦亡是否为其主要发病机制也有待进一步研究。