方 灵， 韦 航， 黄 彪， 司瑞茹， 史梦竹， 阮雅娟， 傅建炜*

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建福州 350003;2.福建省农产品质量安全重点实验室，福建福州 350003;3.宁德市产品质量检验所，福建宁德 352100)

水产品因其富含蛋白质，广受人们喜爱，在人们的饮食结构中占有重要地位[1]。有研究发现，拟除虫菊酯等农药用于水产养殖业中，可以预防和控制寄生虫病和微生物病等疾病，以提高生产效率[2,3]。农药残留通过食物链最终富集在人体中，长期摄入含有农药残留的食物，可对人类神经、免疫、心血管等系统产生毒性作用[4]。此外，农药残留对环境也产生越来越大影响。随着贸易全球化及水产业快速发展，许多国家和组织越来越注重水产品质量安全。为了保障食品安全，各国政府对水产品中农药残留加大了监督力度，对其限量要求也越来越严格。因此，开发一种快速、准确地筛查水产品中多农药残留的检测方法十分必要。

目前，农药残留的分析方法主要有气相色谱、气相色谱-串联质谱、液相色谱、液相色谱-串联质谱等方法[5 - 7]。气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-串联质谱法存在分析农药种类有限、分析时间较长的缺点。超高效液相色谱-串联质谱法因其具有高选择性、高灵敏度等优点，在同时定性定量检测方面具有显著优势，成为多农药残留检测分析的一个重要技术手段。水产品中含有大量的蛋白质、脂肪等化合物，这些物质不仅会造成仪器污染，而且可能会干扰目标农药的检测。因此建立一种高效的前处理方法十分关键。常见的提取方法有固相萃取法[8]、液-液萃取法[9]、分散固相萃取法[10 - 12]等，但固相萃取法、液-液萃取法等方法存在耗时长、前处理操作复杂等缺点。分散固相萃取具有快速便捷、成本低廉、萃取效率高等特点，广泛应用于样品前处理。本研究筛选和优化了提取溶液及净化方法，建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中70种农药残留的分析方法，该方法可以为水产品中多农药残留风险评估及风险预警提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu LC-MS8050超高效液相色谱-串联质谱仪(日本，岛津公司)；T18均质机(德国，IKA公司)；TurboVap氮吹仪(瑞典，Biotage公司)；KQ-500DE超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；Anke TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；Milli-Q超纯水器(美国，Millipore公司)。

农药标准品(天津阿尔塔科技有限公司)。甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，上海麦克林公司)；NH4Ac(色谱纯，美国Fish Chemical公司)；无水MgSO4(分析纯，西陇科学股份有限公司)；NaCl(分析纯，国药集团股份有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18(天津博纳艾杰尔科技公司)。实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液配制

准确吸取各标准品，用甲醇混匀并定容，配制成10 μg/mL的混合标准储备溶液，于-20 ℃下密闭保存。准确移取一定量的混合标准储备溶液，配制成质量浓度为0.2、0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 ng/mL的系列空白基质标准溶液，现配现用。

1.3 样品前处理

按照国家标准(GB/T 30891-2014)《水产品抽样规范》制样，取可食用部分均质后，于-20 ℃下密闭保存。准确称取2.00 g(精确至0.01 g)样品至15 mL聚丙烯离心管中，加入5 mL超纯水，均质1 min后，依次加入10 mL 1%甲酸乙腈溶液、2 g NaCl，漩涡振荡10 min后，以5 000 r/min离心10 min，移取上清液至另一离心管中，按上述方法重复提取一次，合并上清液，待净化。

取5 mL上清液，加入150 mg PSA、150 mg C18及150 mg无水MgSO4，涡旋混匀，以5 000 r/min离心5 min，取上清液，于40 ℃下氮吹近干，用初始流动相溶解并定容至1 mL，过0.22 μm PTFE滤膜后，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 液相色谱条件Waters Acquity UPLC TSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液；B为甲醇。梯度洗脱程序：0～1.0 min，90%A；1.0～4.0 min，90%～50%A；4.0～12.0 min，50%～25%A；12.0～14.0 min，25%～5%A；14.0～18.0 min，5%A；18.0～18.1 min，5%～90%A；18.1～23.0 min，90%A。流速：0.30 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2.0 μL。

1.4.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI源)；多反应监测模式(MRM)扫描；雾化气流量：3 L/min；加热气流量：10 L/min；干燥气流量：10 L/min；接口温度：400 ℃；脱溶剂温度：650 ℃；脱溶剂管(DL)温度：250 ℃。其他质谱参数详见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件优化

本研究中大部分农药是极性物质，为改善峰形及达到更理想分离效果，分别考察了Acquity UPLC TSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)和Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)两种色谱柱对70种农药的分离效果。结果显示，Acquity UPLC TSS T3色谱柱分离效果更佳，多数目标物的峰形相对尖锐对称，可能是由于TSS T3色谱柱是硅胶基质色谱柱，对极性分子具有较好的保留。因此，本研究选取Acquity UPLC TSS T3柱作为此次研究的色谱柱。

不同目标物在不同离子模式下响应不同，根据70种农药的化学电离性质，本研究选择正、负离子模式同时监测，以提高检测效率。在流动相中加入一定量的甲酸、NH4Ac可以提高离子化效率，起到改善峰形、提高灵敏度的效果。本研究流动相选用0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液与甲醇，能够提高多数目标物的信号响应强度，分离效果良好。通过质谱扫描分析，选择响应强度较高的前体离子、产物离子，对各目标物分析所选用的脱溶剂温度、碰撞能量等参数进行优化，确定了定量离子对与定性离子对之间的离子比率，并设定合适驻留时间。各农药的前体离子、产物离子、碰撞能量等信息见表1。图1为最优条件下空白鳗鱼样品加标后(5 μg/kg)总离子流色谱图。

表1 70种农药质谱信息参数

(续表1)

图1 空白鳗鱼样品加标后(5 μg/kg)的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatogram of blank eel spiked with 5 μg/kg of analytes

2.2 前处理方法优化

2.2.1 提取溶剂的优化对于多残留筛查，建立一个简便、可靠的提取方法十分关键。乙腈、酸化乙腈溶液等是农药残留分析中比较常用提取溶剂。本研究比较了乙腈、0.5%甲酸-乙腈溶液、1%甲酸-乙腈溶液、2%甲酸-乙腈溶液4种提取溶剂对70种目标物的提取效率。在空白样品中添加适量农药混合标准溶液，在相同条件下处理，进行添加回收试验。结果显示，随着甲酸含量增大，目标物的回收率逐渐增大，以1%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂时，大部分农药平均回收率较高，当继续增大甲酸含量，目标物的回收率趋于平稳。可能是由于乙腈对多数农药具有较好的溶解度且乙腈能够使蛋白沉淀，减少一些弱极性物质干扰，加入一定量甲酸后，有利于一些酸性农药提取。综合考虑，本研究采用1%甲酸-乙腈溶液为提取溶剂。

2.2.2 净化方法的优化PSA、C18等常作为净化剂，正己烷可以去除脂肪等物质，PSA是弱阴离子交换吸附剂，可以去除样品基质中的脂肪酸等物质，C18主要用于去除样品基质中脂类等弱极性干扰物等，无水MgSO4能有效吸收水分。本研究分别考察了正己烷、PSA、C18及冷冻方法等对鳗鱼样品提取液的净化效果。方法(1)：150 mg PSA+150 mg C18+150 mg MgSO4。方法(2)：150 mg PSA+150 mg MgSO4。方法(3)：150 mg C18+150 mg MgSO4。方法(4)：取5 mL提取液，加入6 mL正己烷。方法(5)：提取液于-20 ℃下冷冻6 h。不同净化方法对目标农药的添加回收影响见图2。结果表明，与其他净化方法相比，使用方法(1)，大部分目标组分回收率较高，在该净化方式下能够获得良好的净化效果，能够满足分析测试的要求。

2.3 方法的定量限

根据每种农药响应值，配制系列空白基质匹配标准工作溶液，在上述色谱及质谱条件下分析，外标法定量。以10倍信噪比(S/N≥10)得到方法的定量限(LOQ)，定量限结果见表2，定量限在0.5～5 μg/kg范围内。在0.2～100 ng/mL线性范围内呈良好的线性关系，线性方程相关系数(r2)均大于0.99。

表2 水产品中70种农药添加回收率、LOQ、RSD及基质效应(n=6)

(续表2)

2.4 方法的回收率及精密度

以空白鳗鱼、对虾为检测对象，在空白基质中分别添加低、中、高3个加标水平标准溶液，进行添加回收试验。每个水平重复测定6次，进行精密度试验。按照本研究建立的前处理方法处理后进行UPLC-MS/MS测定，计算回收率及相对标准偏差(RSD)。结果表明，在加标水平为1～20 μg/kg时，平均回收率范围为70.2%～119.6%，RSD在3.6%～9.8%之间。70种农药加标为10 μg/kg时在不同基质中回收率及精密度见表2。表明该方法准确度及精密度能满足水产品中70种农药残留筛查分析的要求。

2.5 基质效应

基质效应(Matrix Effect，ME)一般是共提取物对目标物的影响[13]。本研究通过考察空白基质中标准溶液响应强度(A)与纯溶剂中标准溶液响应强度(B)，比较二者的比值大小，反映该方法的基质效应，即ME=A/B×100%。一般情况下，基质效应分为五类[14]，ME小于50%为强基质抑制效应，ME在50%～90%为中等基质抑制效应，ME在90%～110%之间等同于无基质效应，ME在110%～150%之间为中等基质增强效应，ME大于150%为强基质增强效应。本研究考察了鳗鱼、对虾两种基质对目标物的影响(表2)，在鳗鱼和对虾基质中，分别有32项农药、16项农药产生中等基质抑制效应，11项农药、6项农药的基质效应为中等基质增强效应，其余农药在二者基质中没有基质效应。为降低基质效应影响，本研究采用空白基质匹配外标法定量，对基质效应进行校正，以提高定量结果的准确性。

2.6 实际样品分析

采用所建立的方法对市场上对虾进行农药残留筛查分析，共采集样品10份。结果显示，其中2份对虾样品检出二嗪磷，含量分别为1.2 μg/kg、2.1 μg/kg，其余样品未检出农药或结果低于定量限。

3 结论

本研究建立了一种水产品中多农药残留筛查分析方法，采用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中杀虫剂、杀菌剂、除草剂等70种农药残留。样品经1%甲酸-乙腈溶液提取，利用PSA、C18以及无水MgSO4分散固相萃取，在多反应监测模式下进行定性定量分析，各农药定量限在0.5～5 μg/kg之间。该方法灵敏度高、准确度高、高通量，能够满足水产品中多农药残留筛查分析的检测要求，为水产品中多农药残留风险评估提供技术支撑。