黄泓轲罗健玮冉华

（1.乐山职业技术学院药学系，四川 乐山614000； 2.乐山职业技术学院医学系，四川 乐山614000；3.重庆市黔江中心医院心内科，重庆409000）

动脉粥样硬化是一种病因复杂的慢性疾病，内皮细胞损伤及功能障碍是动脉粥样硬化的始动环节，参与动脉粥样硬化的进展过程［1］。药物治疗是动脉粥样硬化及其相关心血管疾病的主要治疗手段之一，因此有必要筛选有效的预防和治疗动脉粥样硬化的药物，并探讨其作用机制，寻找敏感的靶点［2］。阿魏酸钠是传统活血化瘀类中药当归、川芎等的主要成分，具有抗细胞凋亡、抑制血小板聚集、抗血栓形成等作用［3］。阿魏酸钠通过抑制p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路能够有效降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的细胞凋亡，发挥内皮保护作用［4］，阿魏酸钠还能促进内皮细胞的增殖和迁移［5］。核因子-κB（NF-κB）信号通路参与炎症反应、内皮细胞损伤、氧化应激等过程，其可促进动脉粥样硬化的进展［6］，抑制NF-κB p65 信号通路激活可减弱内皮细胞的增殖和迁移［7］。阿魏酸钠可通过抑制NF-κB p65 核转位减轻缺血再灌注大鼠脑神经细胞炎症反应，发挥脑保护作用［8］。沉默miR-136-5p通过靶向标IκB 激酶β（IKKβ）调控NF-κB 信号通路改善大鼠脊髓损伤［9］。因此，用ox-LDL 损伤人脐静脉内皮细胞EA.HY926 建立体外细胞模型，研究阿魏酸钠通过miR-136-5p 调控NF-κB 信号通路对ox-LDL 诱导内皮细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料

人脐静脉内皮细胞株EA.HY926 购自中国科学院上海细胞库。阿魏酸钠（纯度＞98%）购自北京索莱宝科技有限公司。DMEM 培养基、胎牛血清购自美国HyClone 公司；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）购自上海泽叶生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒购自日本同仁研究所；蛋白提取试剂盒、BCA 试剂盒购自北京凯瑞基生物科技有限公司；TRIzol 试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa 公司。Transwell 小室、Matrigel 购自美国BD 公司。

2 方法

2.1 细胞处理与分组 人脐静脉内皮细胞株EA.HY926 培养于含10% 胎牛血清的DMEM 培养基中，培养条件为37 ℃、5% CO2，待细胞融合至90% 左右时进行传代。用50 μg／mL ox-LDL 诱导EA.HY926 细胞模拟动脉粥样硬化模型，为ox-LDL 组；正常培养的细胞作为对照组；分别用25、50、100 μmol／L 阿魏酸钠和50 μg／mL ox-LDL 处理EA.HY926，为不同浓度阿魏酸钠组。将miR-NC、miR-136-5p、anti-miR-NC、anti-miR-136-5p 转染至EA.HY926 细胞中，再用50 μg／mL ox-LDL 处理，分别记为miR-NC＋ox-LDL 组、miR-136-5p＋ox-LDL 组、anti-miR-NC＋ox-LDL 组、anti-miR-136-5p ＋ox-LDL 组；将miR-NC、miR-136-5p 转染至EA.HY926 细胞中，用50 μg／mL ox-LDL 和50 μmol／L 阿魏酸钠处理，分别记为阿魏酸钠＋miR-NC＋ox-LDL 组、阿魏酸钠＋miR-136-5p＋ox-LDL 组。

2.2 CCK-8 法检测细胞活力 各组细胞培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂孵育2 h，酶标仪检测各组细胞在450 nm 波长处的光密度值（OD），以OD值表示细胞活性。

2.3 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 收集各组细胞，取200 μL 接种于Transwell 小室上层，培养24 h，PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%结晶紫染色10 min，显镜下拍照并计数发生迁移的细胞数量。细胞侵袭实验除用Matrigel 包被Transwell 小室上室外，其余操作同细胞迁移实验。

2.4 Western blot 法检测Ki67、MMP2、MMP9、p-p65、p-IкBα 蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA 法进行定量，将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜，加入二抗（1∶2 000）室温孵育90 min，洗膜，用ECL 发光液显影，成像，用Quantity One 软件测定蛋白条带的灰度值。

2.5 RT-qPCR 检测miR-136-5p表达 提取细胞总RNA，反转录成cDNA，进行PCR 扩增，每个样品重复3次，扩增条件为95 ℃30 s，60 ℃35 s，72 ℃30 s，共40 个循环。采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达。以U6 为内参，miR-136-5p正向引物序列 5′-ACTCCATTTGTTTTG ATGATG-3′，反向引物序列 5′-GCTGTCAACGATACGC TACGTAAC-3′；U6 正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3′，反向引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2.6 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，结果以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞活力的影响 与对照组比较，ox-LDL 组内皮细胞Ki67 蛋白表达降低，细胞活性降低（P＜0.05）；与ox-LDL 组比较，不同浓度阿魏酸钠处理组Ki67 蛋白表达升高，细胞活性升高（P＜0.05），见图1、表1。

图1 各组内皮细胞Ki67 蛋白表达

表1 不同浓度阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞活力的影响（， n＝9）

表1 不同浓度阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞活力的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ox-LDL 组比较，＃P＜0.05。

3.2 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞迁移和侵袭的影响 与对照组比较，ox-LDL 组内皮细胞MMP2、MMP9 蛋白表达降低，迁移和侵袭细胞数降低（P＜0.05）；与ox-LDL 组比较，50 μmol／L 阿魏酸钠＋ox-LDL 组内皮细胞MMP2、MMP9 蛋白表达升高，迁移和侵袭细胞数升高（P＜0.05），见图2、表2。

图2 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞迁移和侵袭的影响

表2 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞迁移和侵袭的影响（， n＝9）

表2 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞迁移和侵袭的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ox-LDL 组比较，＃P＜0.05。

3.3 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞miR-136-5p表达的影响 与对照组比较，ox-LDL 组ox-LDL 诱导内皮细胞miR-136-5p表达升高（P＜0.05）；与ox-LDL 组比较，50 μmol／L阿魏酸钠＋ox-LDL 组ox-LDL 诱导内皮细胞miR-136-5p表达降低（P＜0.05），见表3。

表3 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞miR-136-5p 表达的影响（， n＝9）

表3 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞miR-136-5p 表达的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ox-LDL 组比较，＃P＜0.05。

3.4 miR-136-5p 对ox-LDL 诱导内皮细胞活性、迁移和侵袭的影响 与miR-NC＋ox-LDL 组比较，miR-136-5p＋ox-LDL组内皮细胞miR-136-5p表达升高，Ki67、MMP2、MMP9 蛋白表达降低，细胞活性降低，迁移、侵袭细胞数降低（P＜0.05）；与anti-miR-NC ＋ox-LDL 组比较，anti-miR-136-5p ＋ox-LDL 组内皮细胞miR-136-5p表达降低，Ki67、MMP2、MMP9 蛋白表达升高，细胞活性升高，迁移、侵袭细胞数升高（P＜0.05），见图3、表4。

图3 miR-136-5p 对ox-LDL 诱导内皮细胞迁移、侵袭和蛋白表达的影响

表4 miR-136-5p 对ox-LDL 诱导内皮细胞活性、迁移和侵袭的影响（， n＝9）

表4 miR-136-5p 对ox-LDL 诱导内皮细胞活性、迁移和侵袭的影响（， n＝9）

注：与miR-NC＋ox-LDL 组比较，*P＜0.05；与anti-miR-NC＋ox-LDL 组比较，＃P＜0.05。

3.5 miR-136-5p 逆转阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞活性、迁移和侵袭的作用 与miR-NC＋50 μmol／L 阿魏酸钠＋ox-LDL 组比较，miR-136-5p＋50 μmol／L 阿魏酸钠＋ox-LDL组内皮细胞miR-136-5p表达升高，Ki67、MMP2、MMP9 蛋白表达降低，细胞活性降低，迁移、侵袭细胞数降低（P＜0.05），见图4、表5。

表5 miR-136-5p 逆转阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞活性、迁移和侵袭的影响（， n＝9）

表5 miR-136-5p 逆转阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞活性、迁移和侵袭的影响（， n＝9）

注：与miR-NC＋50 μmol／L 阿魏酸钠＋ox-LDL 组比较，*P＜0.05。

图4 miR-136-5p 逆转阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞迁移、侵袭和蛋白表达的影响

3.6 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞NF-κB 信号通路蛋白表达的影响 与对照组比较，ox-LDL 组内皮细胞p-p65、p-IкBα 蛋白表达升高（P＜0.05）；与ox-LDL组比较，50 μmol／L阿魏酸钠＋ox-LDL 组内皮细胞p-p65、p-IкBα 蛋白表达降低（P＜0.05）；与miR-NC＋ox-LDL 组比较，miR-136-5p＋ox-LDL 组内皮细胞p-p65、p-IкBα 蛋白表达升高（P＜0.05）；与miR-NC＋50 μmol／L 阿魏酸钠＋ox-LDL 组比较，miR-136-5p＋50 μmol／L 阿魏酸钠＋ox-LDL 组内皮细胞p-p65、p-IкBα 蛋白表达升高（P＜0.05），见图5、表6。

图5 各组内皮细胞p-p65、p-IкBα 蛋白表达

表6 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞NF-κB 信号通路蛋白表达的影响（， n＝9）

表6 阿魏酸钠对ox-LDL 诱导内皮细胞NF-κB 信号通路蛋白表达的影响（， n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与ox-LDL 组比较，＃P＜0.05；与miR-NC＋ox-LDL 组比较，△P＜0.05；与miR-NC＋50 μmol／L 阿魏酸钠＋ox-LDL组比较，＆P＜0.05。

4 讨论

动脉粥样硬化是引起多种心脑血管疾病的主要原因，内皮细胞的损伤和功能性障碍是动脉粥样硬化形成第一步，减轻内皮细胞损伤是防治动脉粥样硬化的途径之一［10］。阿魏酸钠能够缓解同型半胱氨酸导致的人脐静脉内皮细胞功能障碍［11］，也可通过下调趋化因子配体1（CXCL1）基因表达对ox-LDL 损伤的人脐静脉内皮细胞起保护作用［12］。阿魏酸钠治疗冠心病患者有较好的效果，可以有效保护血管内皮功能［13］。本研究显示，阿魏酸钠处理后，内皮细胞Ki67 蛋白表达升高，细胞活性升高，MMP2、MMP9 蛋白表达升高，迁移和侵袭细胞数增加，表明阿魏酸钠可促进内皮细胞增殖、迁移和侵袭，对ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤有保护作用。

miRNA 参与调控动脉粥样硬化形成、发展的病理生理过程，参与调节血管内皮细胞的生物学功能［14］。利帕舒地尔可通过上调miR-136-5p 减轻RPE 细胞的炎症损伤［15］。miR-136-5p 对内皮细胞生物学功能的影响尚未明确。本研究显示，抑制miR-136-5p 表达后，ox-LDL 诱导的内皮细胞中Ki67 蛋白表达升高，细胞活性升高，MMP2、MMP9 蛋白表达升高，迁移和侵袭细胞数升高，表明抑制miR-136-5p 表达可促进ox-LDL 诱导的内皮细胞增殖、迁移和侵袭。阿魏酸钠可下调miR-136-5p 表达；而过表达miR-136-5p 逆转了阿魏酸钠对ox-LDL 诱导的内皮细胞增殖、迁移和侵袭的作用。提示，阿魏酸钠可能通过下调miR-136-5p 表达影响内皮细胞增殖、迁移和侵袭。

NF-κB 信号通路在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥重要的作用［16］。miR-98 可能通过负性调控NF-κB 信号通路抑制ox-LDL 诱导的动脉粥样硬化早期血管内皮损伤［17］。甲基莲心碱通过抑制NF-κB 信号通路，减轻脂多糖诱导的血管内皮细胞损伤，从而抗动脉粥样硬化［18］。吐根碱通过抑制NF-κB 信号通路能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖、侵袭、迁移能力［19］。本研究显示，阿魏酸钠处理后，内皮细胞p-p65、p-IкBα 蛋白表达降低，表明阿魏酸钠可抑制NFκB 信号通路。而过表达miR-136-5p后，内皮细胞p-p65、p-IкBα 蛋白表达升高，表明过表达可激活NF-κB 信号通路；且过表达miR-136-5p 逆转了阿魏酸钠对p-p65、p-IкBα蛋白表达的抑制作用。

综上所述，阿魏酸钠可能通过下调miR-136-5p 表达抑制NF-κB 信号通路，进而抑制内皮细胞的增殖、迁移和侵袭。