施佳君 陈 宇 杨钦钦 马全鑫 富丹婷 陈姣姣 李园园 陈民利#

1 浙江省中医药研究院 浙江杭州 310007

2 浙江中医药大学 浙江杭州 310053

冠心宁片由丹参和川芎组成的复方制剂，具有活血化瘀、通脉养心之功效，现已是临床上治疗稳定性冠心病心绞痛（心血瘀阻证）的常用药物。研究显示，冠心宁片可有效增加麻醉犬冠脉流量，改善心脏的血流动力学[1]，前期动物实验发现冠心宁片有降血压作用，离体血管环实验发现冠心宁片有扩血管作用，且其扩血管作用与血管环内皮细胞中的钙离子通道及钙调蛋白有很大的关系[2]。本研究拟通过动物实验研究冠心宁片对气滞血瘀大鼠血液流变和表皮血流灌注的改善作用，并通过离体实验探究微循环的改善与血管平滑肌细胞中的钙离子之间的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物：SPF 级雄性SD 大鼠36 只，体质量为200±10g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK（沪）2017-0005］；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障环境实验室［SYXK（浙）2013-0184］；环境温度：22±1℃；相对湿度50%～65%；光照12小时明暗交替（早7∶30～晚19∶30）；噪音：＜50dB。大鼠饲养于IVC 中，每笼3 只饲养，自由饮食；试验期间，遵循3R 原则给予实验动物人道主义的关怀。

1.2 主要试剂与仪器：分述如下。

1.2.1 主要试剂：去氧肾上腺素（7161001）购于上海禾丰制药有限公司，肝素（141209）购于常州千红生化制药股份有限公司。无钙Krebs 液成分（mmol/L）：NaCl 120.8，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO4.7H2O 1.2，NaHCO325，葡萄糖11.0，EGTA 0.1，pH 调整到7.4。无钙高钾（40mmol/L）Krebs 液的成分（mmol/L）：NaCl 85.5，KCl 40，KH2PO41.2，MgSO4.7H2O 1.2，NaHCO325，葡萄糖11.0，PH调整到7.4。

1.2.2 主要仪器：BY-N6B 型全自动模块血液流变仪（北京普力生精密仪器研究中心），PeriSean PIMⅡ型激光多普勒血流灌注成像仪(瑞典PERIMED 公司)，HSS-1B型恒温浴槽、SQG-4 型四腔器官浴槽系统（成都仪器厂），MedLab生物信号采集处理系统（南京美易公司）。1.3 动物分组与造模：将36只SD大鼠按体重随机分成6 组，即空白对照组、模型对照组、冠心宁片低、中、高剂量组和冠心宁注射液组。空白对照组和模型对照组每日灌胃生理盐水（NS）10ml/kg，冠心宁低、中、高剂量组每日分别灌胃相应低（15mg/ml）、中（30mg/ml）、高浓度（60mg/ml）的冠心宁片溶液10ml/kg，冠心宁注射液组给予原液1ml/kg，连续14 天。于第14 天给药1 小时后，除空白组大鼠外，其他各组大鼠皮下注射0.1%肾上腺素0.8ml/kg，2小时后将大鼠浸入冰水中5分钟，隔2小时再皮下注射0.1%肾上腺素0.6ml/kg[3]。

1.4 指标观察与测定：分述如下。

1.4.1 一般情况观察：观察各组大鼠的症状改变、行为活动活跃程度及精神状态。

1.4.2 微循环检测：次日给药1小时后，经3%戊巴比妥钠麻醉（0.15ml/kg），用激光多普勒成像仪检测大鼠耳朵（整个耳廓区域）、腹部（腹中左侧定点区域）、脚踝（关节位置）的血流情况。本研究使用扫描模式（NR），扫描面积(Width2.8cm，Height2.1cm)，扫描精度（Middle），采样频率（8 图像/s），距离（9.9cm），分辨率（0.06mm），激光波长为670 nm 进行扫描并对血流图片进行记录、分析、处理及储存。

1.4.3 血黏度检测：激光多普勒检测完，快速心脏取血，取2ml 放入含20μl 肝素钠的塑料管，即刻颠倒混匀，用于血黏度的测定。

1.5 离体血管环实验测定冠心宁片对平滑肌细胞中钙离子（Ca2+）的影响：分述如下。

1.5.1 Ca2+对冠心宁片舒张血管的作用：先将血管环于无钙Krebs液中以2g最适静息张力平衡2h后，换无Ca2+高K+Krebs 液平衡20min，再向浴槽内加入2.5mmol/L的CaCl2收缩血管直至稳定，然后每隔10min 向浴槽内依次加入终浓度分别为0.5、1、2、4、8mg/ml的冠心宁片溶液，对照组以生理盐水代替药物等容加入，以2.5 mmol/L CaCl2诱发最大收缩幅度为100%，以加入不同浓度的冠心宁片溶液后的血管张力幅度与CaCl2诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化，并作量-效曲线。另外前期去极化操作一致，使用4mg/ml的冠心宁溶液孵育去内皮血管环10min，记录此时的收缩幅度为100%，以加入不同浓度的CaCl2后的血管张力幅度与未加CaCl2时的收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化，并作量-效曲线。

1.5.2 冠心宁片对肝素预处理的血管环的作用：以无钙Krebs液预处理去内皮的血管环，观察8mg/ml的冠心宁片对10-6mol/L PE 预收缩血管环的作用，然后用无钙Krebs 液洗脱恢复至基线，并平衡20min 后，以50mg/L 肝素预处理去内皮血管环15min，再观察8mg/ml 的冠心宁片对10-6mol/L PE 预收缩血管环的作用。比较前后两次血管环收缩的程度，对照组以生理盐水代替药物等容加入。

1.5.3 冠心宁片对咖啡因诱导的血管环的作用：以无钙Krebs液预处理去内皮的血管环，加入50mM的咖啡因预收缩血管环，观察8mg/ml 的冠心宁片对血管环的作用，对照组以生理盐水代替药物等容加入。以50mmol 的咖啡因诱发最大收缩幅度为100%，以加入8mg/ml 的冠心宁片后的血管张力幅度与咖啡因诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。

1.6 统计学方法：用SPSS 19.0 软件进行统计分析，所有数据以平均数±标准误（±s）表示，计量资料应用ANOVA 方差分析评价试验结果，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察情况：与空白对照组比较，各组冰水浴之后均出现打寒颤，喷嚏，流涕，背弓毛松，唇口鼻耳四肢色紫等症状。造模后各组出现耳廓欠润泽，微血管呈暗红色，大便稀等情况，行为活跃程度均降低，其中模型组更为严重，冠心宁片给药组较模型组症状均有不同程度的缓解，冠心宁片中高剂量组效果更为明显，冠心宁注射液组与冠心宁片中高剂量组效果相似。

2.2 微循环检测结果：与空白对照组比较，模型对照组的耳朵区域、腹部和脚踝区域的表皮血流灌注明显降低，冠心宁中、高剂量组能增加耳朵区域的表皮血流灌注（P＜0.05），冠心宁高剂量组能显著增加腹部（P＜0.01）和脚踝区域的表皮的血流灌注（P＜0.05）。见图1、图2。

2.3 大鼠血液流变学情况：如表1所示，与空白对照组比较，模型组大鼠在低切、中切、高切三种状态下的全血黏度、红细胞电泳时间及卡松黏度等指标均显著升高（P＜0.01），给予中、高剂量的冠心宁片后均可显著降低低切、中切、高切三种状态下的全血黏度（P＜0.05），给予低、中高剂量的冠心宁片降低红细胞电泳时间和卡松黏度的趋势，但效果均低于阳性药组，均与空白对照组有差距。

表1 冠心宁片对血瘀证大鼠血液流变学的影响（±s）

表1 冠心宁片对血瘀证大鼠血液流变学的影响（±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别空白对照组模型对照组冠心宁片低剂量组冠心宁片中剂量组冠心宁片高剂量组冠心宁注射液组卡松黏度1.05±0.02 1.67±0.10##1.55±0.08##1.54±0.08##1.53±0.04##*1.32±0.09#*剂量10ml/kg NS 10ml/kg NS 150mg/kg 300mg/kg 600mg/kg 1ml/kg全血高切（200/s）3.74±0.07 4.68±0.10##4.36±0.12##4.32±0.06##*4.27±0.07##*4.05±0.17*全血中切（30/s）4.24±0.08 5.36±0.12##5.01±0.14##4.94±0.08##*4.94±0.08##*4.62±0.21*全血低切（3/s）7.45±0.14 10.72±0.21##9.70±0.21##*9.44±0.26##*9.38±0.16##**8.64±0.44**红细胞电泳时间（s）14.04±0.25 16.56±0.49##16.35±0.45##16.55±0.37##16.38±0.30##15.52±0.65

2.4 Ca2+参与冠心宁片对血管环的作用：由图3 可知，给予终浓度为2～8mg/ml 的冠心宁片溶液可使2.5mmol/L CaCl2预收缩的血管环显著舒张（P＜0.01，P＜0.05），4mg/ml 的冠心宁片溶液孵育后，给予0.3～10mmol/L 的CaCl2溶液，血管环收缩被显著抑制（P＜0.01），且呈一定的剂量依赖性。

2.5 冠心宁片对肝素预处理的血管环的作用：由图4可知，用无钙K-H 液加50mg/L 肝素预处理去内皮血管环，给予8mg/ml 的冠心宁片溶液对PE 收缩血管环的舒张作用被显著抑制（P＜0.01）。

2.6 冠心宁片对咖啡因诱导的血管环的作用：由图5可知，用无钙K-H 液预处理去内皮血管环，给予8mg/ml的冠心宁片溶液并不能显著抑制50mmol 的咖啡因诱导的收缩作用（P＞0.05）。

3 讨论

气滞血瘀是冠心病心绞痛的主要病机，本实验根据暴怒、寒邪的病因，采用皮下注射肾上腺素和冰水浴模拟人暴怒时的机体状态和寒邪入侵机体，制备大鼠气滞血瘀模型[3]。中医血瘀的特征为“血液该动而止，瘀血该动而留，脉道该通而塞”[4]。如何活血去瘀？《素问·至真要大论》：“必先五胜，疏其血气，令其调达，而至和平。”[5]冠心宁片由丹参和川芎等组成，具有活血化瘀的功效。实验结果显示，冠心宁片能增加气滞血瘀大鼠的血液流变学，从而改善微循环。

舒张血管是改善微循环的重要环节，而血管平滑肌在血管舒缩中又起到了重要作用。血管平滑肌的收缩最主要受到Ca2+的调控，胞内Ca2+浓度升高是诱导血管收缩的离子基础[6]。在无Ca2+K-H 液中，给予终浓度为2～8mg/ml的冠心宁片溶液可使2.5mmol/L CaCl2预收缩的血管环显著舒张,且呈一定的浓度依赖性，说明冠心宁片能抑制细胞外钙内流，且随着浓度的增加这种作用更加显著。

胞内Ca2+浓度升高主要通过外钙内流和内钙释放实现。钙内流的途径主要有电压依赖性钙通道（VDC）和受体激活性钙通道（ROC）。KCl 引起血管平滑肌细胞去极化，激活电压依赖性的钙通道VDC，使流入胞内的Ca2+与内质网膜的ryanodine 受体结合，促使内钙释放，引起血管收缩[7]。本研究将血管环用无钙高钾的营养液处理，使血管平滑肌细胞外的K+浓度远大于细胞内，诱导K+内流及平滑肌去极化，导致VDC 开放。结果显示，预先孵育冠心宁片溶液后再加入梯度浓度的CaCl2，则血管环的收缩程度明显减弱，说明冠心宁片可以抑制VDC介导的细胞外Ca2+内流，进而抑制血管平滑肌细胞收缩，发挥血管舒张的作用。另外，在血管平滑肌细胞膜上磷脂酶C（PLC）能将肌醇磷脂分解成二磷酸磷脂酰肌醇产生第二信使三磷酸肌醇（IP3），IP3与特异性受体结合后可引起胞内Ca2+池释放Ca2+，使细胞内游离Ca2+浓度升高，进而对血管产生较强的收缩作用[8]。

本研究用IP3受体拮抗剂肝素预处理去内皮血管环，阻断IP3诱导的内钙释放[9]，结果显示冠心宁片对PE收缩的血管环舒张作用被显著抑制，故推测冠心宁片可阻断ROC。咖啡因诱导的收缩是由咖啡因敏感钙池的Ca2+释放导致的，冠心宁片并不能显著抑制咖啡因的收缩作用，故推测冠心宁片并不是通过抑制咖啡因敏感钙池的Ca2+释放而起到舒张血管的作用。本课题组前期的研究表明冠心宁片能抑制细胞外Ca2+内流和细胞内Ca2+释放，该结果进一步印证了前期的实验结论。

因此，笔者认为冠心宁片通过降低肌细胞内的Ca2+浓度改善微循环，降低胞外Ca2+内流和细胞内Ca2+释放，VDC 和ROC 可能是其外Ca2+内流的靶点，内质网上IP3可能是其细胞内Ca2+释放的靶点。