祝传顺 周振发 洪 禹 薛 莹 姚 雷 朱卫华

（北京智飞绿竹生物制药有限公司，北京市细菌性疫苗工程技术研究中心，北京 100176）

无细胞百白破联合疫苗作为计划免疫品种，在我国得到了广泛应用，可有效预防百日咳、白喉、破伤风，其中破伤风疫苗的主要成分为破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）［1］。2020 版《中国药典》三部采用絮状单位测定法检测TT抗原含量，结果判定为肉眼观察，较为主观，存在一定误差［2］。建立和完善TT 抗原的ELISA 方法是非常必要的。目前欧美国家吸附无细胞百白破（组分）联合疫苗（DTaP）生产工艺过程中均采用ELISA 法进行质量控制，而国内许多厂家主要侧重于构建百日咳类毒素（pertussis toxoid，PT）、百日咳丝状血凝素（filamentous hemag⁃glutinin，FHA）与百日咳黏附素（pertactin，PRN）抗原的ELISA检测方法［3-5］。本文采用TT为包被抗体，建立双抗体夹心ELISA 法精确定量TT抗原含量，以期为破伤风疫苗质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 TT 抗毒素絮状反应标准品（0022，950 Lf/支）购自中国食品药品检定研究院；大鼠抗TT抗体由本实验室制备；羊抗大鼠IgG-HRP 购自Sigma-Aldrich；TT 抗原标准品（04/150，690 Lf/支）购自英国国家生物制品研究所，稀释至2 Lf/ml 备用；TT 抗原（批 号：20190505T-1、20190505T-2、20190505T-3、20190505T-4、20190505T-5、20190505T-6）、DTaP 实验 样 品（批 号：20180101、20180102、20180103、20200101、202004002、202005003、202005004）和氢氧化铝佐剂均由本实验室提供；DTaP市售品（批号：R3L38、U3D57、ROC941M）购自赛诺菲-巴斯德公司；405LSR 型洗板机购自美国伯腾仪器有限公司；Spectra Max 190 型酶标仪购自美国美谷分子仪器有限公司；Legend Micro17 型台式离心机购自Thermo Fisher；DPX-9272132 型恒温培养箱购自上海福玛设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 包被抗体和检测抗体工作浓度确定 将TT抗毒素（100 Lf/ml）分别稀释为2、1、0.5、0.25 Lf/ml包被酶标板，大鼠抗TT 检测抗体分别稀释2 000、5 000、10 000、20 000 倍进行棋盘滴定，羊抗大鼠IgG-HRP 抗体10 000 倍稀释，检测0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 813、0.003 906、0.001 953、0.000 976 7、0.000 488 35 Lf/ml 系列稀释TT 抗原标准品，根据0.125 Lf/ml标准品450 nm处吸光度A450>1.0、0～0.062 5 Lf/ml TT 抗原浓度区间标准曲线相关系数（r）>0.99、阴性对照（NC）A450<0.1 这3 条标准筛选最佳包被浓度和检测抗体浓度［6-7］。

1.2.2 双抗体夹心ELISA 法构建 采用碳酸盐缓冲液（pH=9.6）将TT（100 Lf/ml）稀释至0.25 Lf/ml，包被酶标板，37 ℃孵育1 h，按照常规ELISA 操作步骤进行，加入TMB底物液显色，2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定A450［6-7］。

1.2.3 双抗夹心ELISA法验证

1.2.3.1 线性关系的重复性 建立絮状单位（Lf/ml）对应A450的log-log 直线回归方程，确定最佳线性关系，实验重复8 次，计算8 次检测的r值，r2均应>0.99，考察线性关系的重复性。

1.2.3.2 特异性 将高浓度TT 抗原和DT 抗原及100 ng/ml PT 抗原、FHA 抗原、PRN 抗原作为待检品，磷酸盐缓冲液作为阴性对照，进行双抗体夹心ELISA法特异性评价。以阴性对照（NC）A450的2.1倍作为判定阴性与阳性的标准［8-9］。

1.2.3.3 准确度、精密度验及定量限确定 定量限：检测准确稀释的0.002 5、0.0012 5、0.000 625、0.000 312 5 Lf/ml 的TT 抗原标准品，各浓度同批次检测8 次，批间检测3 次，计算实验内和实验间检测的回收率、均值xˉ、标准偏差（s）及变异系数（CV）；准确度及精密度：在磷酸盐缓冲液中分别添加已知的TT抗原标准品至絮状浓度为0.04、0.01、0.002 5 Lf/ml，再进行双抗体夹心ELISA 法检测，各浓度批内重复测 定8 次，批 间 测 定3 次，计 算 检 测 回 收 率、xˉ、s及CV［10］。

1.2.4 氢氧化铝佐剂对TT 抗原的吸附能力测定向TT 抗原中加入氢氧化铝佐剂和0.85%氯化钠溶液，使铝离子终浓度达到0.5 mg/ml，絮状单位分别达到7、21、70、140、350、700、1 400 Lf/ml，搅拌吸附18～24 h，8 000 g 离心5 min，取上清，测定上清TT 抗原含量，结合TT 抗原理论量计算吸附率（%）=（TT 抗原理论量-上清TT 抗原量）/TT 抗原理论量×100%。

1.2.5 抗原吸附率测定 取6 批TT 抗原经氢氧化铝佐剂吸附，使铝离子终浓度达到0.5 mg/ml，TT抗原吸附后浓度分别达到200 Lf/ml，10 mg/ml 加入柠檬酸钠混匀，37 ℃孵育24 h 进行解吸附，解吸附后的供试品和未经解吸附供试品同时8 000 g 离心5 min，分别取上清检测TT 抗原含量，计算抗原吸附率（%）=（解吸附抗原量-未解吸附上清抗原量）/解吸附抗原量×100%，解吸附回收率（%）=解吸附抗原量/理论量×100%。

1.2.6 TT 抗原含量测定 采用已建立的双抗体夹心ELISA 法对6 批TT 抗原含量进行测定，同时与类毒素絮状单位测定法检测结果进行相关性分析。

1.2.7 DTaP 中TT 抗原含量及吸附率测定 采用双 抗 体 夹 心ELISA 法 对7 批DTaP 实 验 样 品、3 批DTaP 市售品的TT 抗原含量及TT 抗原吸附率进行测定。

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0软件进行统计学分析，双抗体夹心ELISA 法与絮状单位测定法相关性分析采用Pearson 相关性分析，判定标准：相关系数r的绝对值在0.5～0.8呈显著相关（或中等程度相关），>0.8 呈高度相关［8，10］。组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双抗体夹心ELISA 法建立 检测抗体浓度10 000 倍稀释，包被抗体浓度为0.25 Lf/ml 时，建立的双抗体夹心ELISA 法在TT 抗原标准品浓度为0～0.062 5 Lf/ml内呈良好线性关系（r2>0.99，图1）。

图1 TT双抗体夹心ELISA法标准曲线建立Fig.1 Establishment of TT double antibody sandwich ELISA standard curve

2.2 双抗体夹心ELISA法验证结果

2.2.1 线性关系的重复性验证 重复试验8 次，r和r2均>0.99，说明建立的线性关系可重复性较好（表1）。

表1 双抗体夹心ELISA法线性重复性验证Tab.1 Verification for linearity repetitive of double anti⁃body sandwich ELISA method

2.2.2 特异性验证 建立的双抗体夹心ELISA 法对高浓度DT 抗原、PT 抗原、FHA 抗原、PRN 抗原的检测结果均为阴性，而对0.2 Lf/ml TT 抗原检测结果为强阳性（表2），表明该方法特异性较好。

表2 特异性验证Tab.2 Specificity verification

2.2.3 准确度、精密度及定量限验证

2.2.3.1 定量限 不同浓度TT 抗原检测结果见表3。TT 抗原标准品稀释至0.000 625 Lf/ml 时，批内和批间回收率分别为102.40%和99.09%，CV分别为4.089%和5.092%，准确度和精密度较好；TT抗原标准品稀释至0.000 312 5 Lf/ml 时，批内和批间回收率分别为77.59% 和72.00%，CV分别为14.44%和15.56%，准确度和精密度较差。因此确定该方法准确检测的最低浓度为0.000 625 Lf/ml。

2.2.3.2 准确度和中间精密度 双抗体夹心ELISA法检测0.0400 0、0.0100 0、0.002 5 Lf/ml 3 个浓度TT 抗原批内回收率分别为89.90%、106.60%、105.20%，批间回收率分别为90.65%、102.87%、103.96%，均在85%～115%范围内，同时3 个浓度批内和批间检测CV均<10%（表3）。表明该检测方法准确度和精密度较好。

表3 精密度及准确度验证Tab.3 Precision and accuracy verification

2.3 双抗体夹心ELISA法检测TT抗原的实际应用

2.3.1 氢氧化铝佐剂对TT 抗原吸附能力的测定铝离子浓度为0.5 mg/ml 时，7～700 Lf/ml 范围内TT抗原吸附率均>90%。随着样品含量增加，吸附率略有下降，TT 抗原含量为1 400 Lf/ml 时，吸附率下降为81.4%（表4）。

表4 佐剂对TT抗原的吸附能力Tab.4 Adsorption capacity of adjuvant to TT antigen

2.3.2 TT 抗原吸附率测定 6 批TT 抗原佐剂吸附后解吸附，絮状单位回收率为97.6%～112.1%，表明该解吸附方法可将TT 抗原从氢氧化铝佐剂上解吸附，解吸附回收率>95%，同时不对双抗体夹心ELISA法测定TT 抗原造成干扰。连续6 批TT 抗原原液吸附率均>98%（表5）。

表5 TT抗原吸附率Tab.5 TT antigen adsorption rate

2.3.3 两种不同方法检测TT 抗原含量结果比较双抗体夹心ELISA法和絮状单位测定法检测结果间变异系数<15%，两种方法检测结果比值为0.93～1.15。采用Pearson 相关性分析发现2 种方法测定结果高度相关（r=0.94）。配对t检验结果显示，2 种方法检测结果差异无统计学意义（t=0.13，P>0.05，表6）。

2.3.4 联合疫苗中TT抗原加入量及吸附率 采用双抗体夹心ELISA 法对7 批DTaP 实验室联合疫苗样品、3 批市售DTaP 联合疫苗成品经解吸附处理测定TT 抗原含量，已知理论加入量为7 Lf/ml，10 批样品均值为7.93 Lf/ml，CV为9.82%。同时测定联合疫苗的TT 抗原吸附率均>99%，说明TT 抗原与DT抗原、PT抗原、FHA抗原、PRN抗原混合，TT抗原未发生解离（表7）。

3 讨论

DTaP联合疫苗已在国内外推广应用，而抗原定量控制已成为质量控制的工作重点。为制备合格的无细胞百白破联合疫苗，建立和完善各种抗原的检测方法是必需的［8］。TT 抗毒素有效抗原含量测定是破伤风疫苗质量控制的重要指标。本文采用TT 和相应酶标抗体建立的双抗体夹心ELISA 法在0～0.062 5 Lf/ml 范围能够建立较理想的线性关系（r2>0.99），方法学验证表明该方法可重复性、特异性和稳定性良好，可靠测量范围为0.000 625～0.040 000 Lf/ml，定量限为0.000 625 Lf/ml。分别采用双抗体夹心ELISA 法和絮状单位测定法测定6 批TT 抗原，配对t检验显示结果间差异无统计学意义（P>0.05），Pearson相关性分析也显示两种检测方法高度相关。

本研究探索了双抗体夹心ELISA 法在TT 抗原质量控制过程中的应用，通过检测氢氧化铝佐剂对TT抗原的吸附能力发现，1 mg铝离子可吸附1 400 Lf TT 抗原，而成品中对应的TT 含量为7 Lf/ml，铝离子含量为0.5 mg/ml，这一结果对于制备高吸附率的多联多价疫苗意义重大。同时探索了双抗体夹心ELISA 法在TT 吸附原液和百白破联合疫苗中的应用。

《中国药典》2020 版中的絮状单位测定法是检测人员以肉眼观察的半定量方法，较为主观，敏感度低，不适用于TT 抗原吸附后的含量测定，难以完成对原液和成品的检测要求［2］；而双抗体夹心ELISA 法能够对抗原吸附工艺前后进行精确定量，可适用于原液和成品检测工作。

综上，本研究建立的双抗体夹心ELISA 法更有利于联合疫苗制备过程中TT抗原的质量控制，对提高我国破伤风疫苗品质具有重要意义。