黄钊希，陆柳桂，高泳，廖新红

(1. 广西医科大学，广西 南宁 530021；2. 广西医科大学第一附属医院超声科，广西 南宁 530021)

癌症是严重危害中国居民健康的重大慢性疾病之一，其发病率及死亡率分别占全球的23.7%、30%[1]。尽管近年来靶向治疗、免疫治疗等新兴疗法已逐步应用于临床，化疗依然是绝大多数恶性肿瘤的主要治疗手段。以阿霉素为代表的蒽环类药物仍是大多数实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤治疗的基础药物，但由于阿霉素毒性大，引发心脏毒性、胃肠道反应、骨髓抑制、脱发和药物外渗等不良反应，限制了其临床应用[2]。

已有研究表明，载药超声纳米泡能作为药物载体，高效运载化疗药物，联合超声辐射作用下，可实现化疗药物定向释放提高疗效，同时减少化疗药物在肿瘤以外的部位聚集，减轻全身毒副作用[3]。目前，载药超声纳米泡的研究众多，其制备条件及成膜材料不同，制备出来的超声纳米泡在各项物理特性和成像特性上均存在一定的差异[4-6]，因而，如何制备安全性高且稳定性好的载药超声纳米泡仍是目前分子影像研究的热点及难点。本实验通过添加聚合物N，N-二乙基丙烯酰胺(N，n-diethyl acrylamide， NNDEA)和表面活性剂Pluronic 124，拟制备一种既安全、稳定且操作简单、成本低的载药超声纳米泡造影剂，通过优化关键制备参数，观察其理化特性，为后续探究载药超声纳米泡的体内肿瘤成像及治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 二棕榈酰磷脂酰胆碱(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇 (1，2-distearoyl-phosphatidylethanol amine-methyl-poly ethylene glycol conjugate-2000，DSPE-mPEG2000)购自北京谨明生物科技有限公司；二棕榈酰磷脂酰胆碱(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolamin，DPPE)、二棕榈酰磷脂酸(1，2 dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphate，DPPA)、甘油、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、盐酸阿霉素(doxorubicin，Dox)、Irgacure 2959、N，N′-双(丙稀酰)胱胺[N，N-bis(acryoyl) cystamine，BAC]均购自上海麦克林生化科技有限公司；N，N′-二乙基丙酰胺(NNDEA)购自上海贤鼎生物科技有限公司；Pluronic 124购自美国Sigma-Aldrich；氯仿购自成都科隆化学品有限公司；全氟丙烷气体(C3F8)购自深圳金谷气体有限公司。

1.2 主要仪器 XS205DU十万分之一天平购自梅特勒-托利多，KQ-501DB超声波清洗仪购自昆山市超声仪器有限公司，XD-W2308加热板购自深圳市兴达恒业科技有限公司，HH-420恒温水浴锅购自金坛市易晨仪器有限公司，HL-AH(G8)银汞调和器购自杭州中润医疗器械有限公司，Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪购自英国马尔文仪器有限公司；光学显微镜购自Olympus，血球计数板购自上海市求精生化试剂仪器有限公司，冷冻干燥机购自德国ALPHA 1-2 LD plus，Synergy H1多功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，85-2恒温磁力加热搅拌器购自常州翔天实验仪器厂，超声治疗仪UT1021购自深圳东迪欣科技有限公司，诊断超声仪GELOGIQ E9。

1.3 实验方法

1.3.1 NBs的制备及优化 ①以质量比为1∶1.5∶4∶1准确称取DPPA、DPPE、DPPC和DSPE-mPEG2000于离心管中，加入氯仿，在37 ℃超声波清洗仪中振荡充分溶解；②随后将澄清的脂质材料混合液转移至样品瓶中，开盖置于65 ℃加热板上作用，去除溶剂，直至瓶内脂质材料呈薄膜状；③取甘油50 μL，以及一定比例的Pluronic 124、Irgacure 2959溶液的混合液1 mL加入薄膜瓶中，加盖密封，65 ℃水浴30 min；④以2∶1的比例加入NNDEA、BAC。⑤抽出瓶内空气并充入C3F8气体。使用银汞调和仪以恒定振荡频率下调整振荡时间，4 ℃倒置分层，下层清液为所需NBs。

1.3.2 Dox-NBs的制备 ①以质量比为1∶1.5∶4∶

1准确称取DPPA、DPPE、DPPC和DSPE-mPEG2000于离心管中，加入氯仿，在37 ℃超声波清洗仪中振荡充分溶解；②随后将澄清的脂质材料混合液转移至样品瓶中，开盖置于65 ℃加热板上作用，去除溶剂，直至瓶内脂质材料呈薄膜状；③取甘油50 μL，以及一定比例的Pluronic 124、Dox、Irgacure 2959溶液的混合液1 mL加入薄膜瓶中，加盖密封，65 ℃水浴30 min；④以2∶1的比例加入NNDEA、BAC；⑤抽出瓶内空气并充入C3F8气体，用银汞调和仪高速振荡60 s，置于254 nm紫外灯下照射30 min，4 ℃倒置分层，下层清液为所需Dox-NBs，以上操作避光进行。

1.3.3 超声纳米泡的表征检测 将Dox-NBs及NBs用PBS稀释相同倍数，采用纳米粒度电位仪检测样本的粒径大小及分散度、Zeta电位(仪器设置条件：T=25 ℃，laser wavelength=660 nm，angle=90)，光学显微镜×400下观察Dox-NBs的一般形态，血球计数板计数Dox-NBs浓度[25×16规格，计数公式：a=(b/5)×25×10000×稀释倍数]。

1.3.4 Dox-NBs中Dox的载药量与包封率测定 采用酶标仪波长λ=483 nm条件下绘制阿霉素浓度-吸光度标准曲线方程备用。将样品瓶中Dox-NBs转移至分子截留量为12 000～14 000 Da透析袋中透析过夜，以去除游离的Dox。采用冷冻干燥机将透析后的样品冻干。将冻干的载Dox纳米颗粒称重，并以1 ∶1的体积比溶解在甲醇和PBS的混合液中。随后使用酶标仪测混合液的吸光度，利用回归方程计算出NBs包封Dox的量。平均载药量=包封Dox的量(μg)/冻干的载Dox纳米颗粒的重量(mg)。包封率=包封Dox的量(μg)/初始Dox投入的量(μg)×100%。

1.3.5 Dox-NBs体外药物释放实验 分为Dox-NBs组和Dox-NBs联合超声治疗仪组。分别取等量Dox-NBs样品加至5 mL置于透析袋中，封口。Dox-NBs组立即放入200 mL PBS容器中，Dox-NBs联合超声治疗仪组在超声治疗仪作用(参数设置：频率3 MHz，占空比20%，声强1 W/cm2，辐照时间3 min)后再加入。将容器置于磁力搅拌器上以100 r/min的速度旋转作用。分别于设定的时间点(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、8 h、11 h、24 h)取容器中透析出的Dox溶液1 mL于小管中，同时补加1 mL的PBS。用酶标仪检测不同时间点所取样品中Dox含量，计算Dox-NBs的累计释放百分比，做出累积释放率-时间曲线图。

1.3.6 Dox-NBs的体外超声显影 将Dox-NBs用PBS按1∶100稀释，置入琼脂糖凝胶制成的孔洞模具中，以PBS为空白对照组。用诊断超声仪(GELOGIQ E9)进行超声造影成像显影(仪器设置：9 L探头，频率8 MHz，机械指数0.13，TIS 0.0，增益6 dB)。

2 实验结果

2.1 振荡时间对NBs粒径大小的影响 粒径检测结果显示，振荡时间为45 s 、60 s、90 s制备的NBs平均粒径分别为(557.69±19.73) nm、(119.20±16.89) nm、(364.00±18.06) nm，三组间平均粒径比较差异有统计学意义(P<0.01)，振荡时间为60 s时，制备所得NBs粒径大小最佳，见图1。

***P<0.001。

2.2 Dox-NBs的表征 成功制备Dox-NBs，外观呈红色浊液，光学显微镜下观察呈球形，大小形态分布均匀，无聚集，见图2。振荡时间均为60 s的Dox-NBs组与对照组NBs的平均粒径分别为(286.93±14.45) nm、(119.20±16.89) nm，两者差异有统计学意义(P<0.01)、Zeta电位分别为(-13.30±2.17) mV、(-11.07±1.33) mV，两者差异无统计学意义(P=0.056>0.05)，见图3。血球计数板计数Dox-NBs浓度(3.17±2.37)×108个/毫升。

图2 光镜 载药纳米泡形态( ×400)

图3 Dox-NBs粒径及Zeta电位分布结果

2.3 Dox-NBs的平均载药量、包封率、体外药物释放 酶标仪阿霉素浓度-吸光度标准曲线为y=0.0005x+0.0417，R2=0.9959，测定Dox-NBs中阿霉素的平均载药量为(45.85±2.17) μg/mg，包封率为(42.40±4.62)%。体外释放实验结果显示，两组所有时间点比较累计释放量差异均具有统计学意义(P<0.05)，Dox-NBs联合超声治疗仪组在时长为5 h时药物释放达50%以上，单纯Dox-NBs组时长为5 h药物释放仅为25%左右，经24 h释放至50%左右，见表1。Dox-NBs联合超声治疗仪组和单纯Dox-NBs组3 h内的药物释放曲线见图4。

表1 Dox-NBs组、Dox-NBs联合超声治疗仪组体外阿霉素累积释放率比较

2.4 Dox-NBs的体外显影评价 在超声造影模式下，体外显影结果显示，Dox-NBs组显示点状强回声，分布均匀。空白对照组的PBS显示为无增强的液性暗区，见图5。

图5 超声造影下载药纳米泡的体外显影情况

3 讨论

稳定性能是载药超声纳米泡发挥作用的重要影响因素。超声纳米泡的制备处方不同，其稳定性不同[7-9]。目前纳米泡的制备多为脂质类外壳，其生物相容性良好，回声强度满意，但稳定性较差[10-11]。因此，

与Dox-NBs联合超声治疗仪组比较，*P<0.05，***P<0.001。

本研究在脂质类外壳基础上尝试通过添加Pluronic 124、NNDEA来提高超声纳米泡的稳定性。Zeta电位结果提示，制备的空白NBs和Dox-NBs在PBS溶液中均有较好的稳定性。表面活性剂Pluronic是一类两亲性高分子材料，可在脂质材料之间排列构成外壳。脂质壳流动性在一定程度上与脂质类纳米泡的稳定性和回声性质相关，Pluronic则通过改变脂质堆积结构及增加外膜流动性降低纳米泡表面张力[12-13]。同时，本研究添加的NNDEA可与Pluronic组成的胶束互穿交联形成更为稳定的网状结构[14]，从而保持纳米泡不被破坏。体外释放实验中，在模拟体内血流循环条件下，没经超声治疗仪作用的Dox-NBs药物释放曲线平缓，药物释放到50%需时间较长，提示Dox-NBs可较好保持稳定的结构，没有外力加促纳米泡破裂的情况下，其装载的药物释放缓慢，有利于下一步药物的定点定位释放研究，这与PERERA R H等[15]研究一致。稳定性良好的Dox-NBs体外超声显影结果显示呈点状均匀强回声，效果良好，为后续进行体内肿瘤诊疗实验提供了良好基础。

超声触发药物递送系统是目前肿瘤诊疗研究中的热点及研究方向。利用肿瘤增强的渗透和滞留效应，以及多数肿瘤内皮间隙可扩大至380～780 nm[16]，因此粒径在此范围内的超声纳米泡可穿过血管抵达肿瘤血管外间质，实现肿瘤细胞显像，还可通过装载药物、基因、连接靶点等形成功能化超声纳米泡，实现靶向治疗。由此可见，除了纳米泡的稳定性以外，粒径大小是影响靶向超声分子成像的另一关键因素。超声纳米泡通过高速振荡使微泡分裂产生[17]，因此，这过程中的振荡参数对粒径大小的影响至关重要。振荡程度不够，微泡不足以分裂产生纳米泡；振荡程度过度，使产生的纳米泡破裂融合，粒径会增加，所以振荡参数的设置非常关键。本实验中采用的是高速水平往复式振荡，振荡频率与振荡幅度相对恒定，因此需对振荡时间的3组设定参数进行筛选。3组样品粒径结果显示，振荡时间为60 s时粒径最佳。本实验制备的Dox-NBs平均粒径为(286.93±14.45) nm，呈单峰分布，分散度好，粒径范围窄，大小形态均匀，无聚集，完全能实现穿越血管内皮细胞间隙实现血管外显像的能力。

近年来，已有较多研究利用载药超声纳米泡降低阿霉素的毒副作用[18-20]。本实验中制备的Dox-NBs平均载药量与包封率实验结果与NITTAYACHARN P等[21-23]研究结果相近。体外阿霉素释放实验显示，Dox-NBs联合超声治疗仪组前24 h阿霉素累计释放量高于Dox-NBs组。表明本实验制备的载药超声纳米泡可有效包裹药物，联合超声辐射作用，可实现肿瘤部位的药物定点定位释放，有望发挥肿瘤精准治疗作用，提高在肿瘤部位的药物浓度，减少全身毒副作用。

综上所述，本实验成功制备了一种粒径小、稳定性好、体外显像效果良好的载阿霉素超声纳米泡，为后续开展体内肿瘤超声分子精准治疗提供了实验依据。