钮妍 王泽中 国生 沈潜 杨靖颐 宋红志 付国兵 王康

在过量运动发生后，由于皮质醇和肾上腺素等应激激素的超量分泌，血流动力学发生显著变化，加之氧化应激水平的急剧升高，导致外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)功能与结构的异常，进而引发暂时性的运动性免疫抑制[1]。此时，机体的防御屏障上就像打开了许多小窗户，学术界称之为免疫系统的“开窗现象”[2]。在这一阶段，不仅会出现疲劳、乏力、注意力下降等主观症状，也会增加各种细菌、微生物、病毒入侵的几率。

本团队在前期研究中发现推拿可显著改善运动性疲劳(exercise-induced fatigue，EF)引起的PBMCs凋亡及亚型分布失衡，从而减轻运动性氧化应激引起的免疫炎性损伤[3]。基于EF状态下引起氧化应激介导的细胞凋亡主要通过线粒体的内源性凋亡途径实现，课题组以调控线粒体能量代谢及细胞凋亡的关键蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activited protein kinase，AMPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)、半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)为切入点，通过分子生物学研究方法，初步探索了推拿改善EF模型大鼠PBMCs凋亡及免疫炎性抑制的调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄SPF级雄性Wistar大鼠30只，体质量(150±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2019-0009。大鼠饲养于医院实验动物中心SPF级动物房，温度18～22℃，相对湿度40%～60%，自由进食和饮水。预训练及造模过程中先后剔除不会跑步大鼠2只及造模失败大鼠4只，最终共有24只大鼠完成实验。本次实验通过北京中医药大学东方医院实验动物伦理委员会审核(编号：201940)。

1.2 实验试剂

蛋白酶抑制剂(瑞士Roche，批号：4693116001)，蛋白染色剂(美国Bio-Rad，批号：5000006)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMP-activited protein kinase,pAMPK，1∶1 000，美国CST，批号：2535S)，AMPK(1∶1 000，美国CST，批号：5832S)，PGC-1α(1∶1 000，美国Affinty Biosciences，批号：AF5395)，caspase-3(1∶1 000，美国SANTA CRUZ，批号：sc-7272)，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(1∶1 000，美国SANTA CRUZ，批号：sc-52012)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(1∶1 000，美国SANTA CRUZ，批号：sc-52746)，GAPDH(1∶4 000，英国Abcam，批号：ab128915)，ECL显影液(美国thermo fisher scientific，批号：NCI5079)，转印膜(德国Merck Millipore，批号：IPVH00010)，HRP二抗(1∶4 000，上海Beyotime，批号：A0208)。

1.3 分组及模型制备

大鼠适应性喂养7天后，采用跑台运动的方法建立运动性氧化应激模型。以坡度为0°，10 m/分钟的速度跑20分钟，每天1次，连续3天，作为大鼠适应性跑台训练。训练后，剔除不会跑步以及体质量数据差异较大的大鼠2只，后随机取出8只大鼠作为空白组。剩余20只大鼠运用改进的递增跑台有氧力竭运动法进行造模，为期7天[4]。采用精神不振、对疼痛刺激反应迟钝、毛散且无光泽等行为学观察指标，并满足随机外周血乳酸含量>10 mmol/L视为造模成功。将16只成模大鼠随机分为模型组及推拿组，每组各8只。

1.4 干预方法

推拿组每日力竭运动后予推拿干预1次，连续21天。干预方案如下：实验施术人员用不透光棉袋套住大鼠头部及胸部，随后将大鼠置于自然俯卧体位，一手轻按大鼠项背部安抚其情绪，另一手运用中指揉法先后作用于双侧天枢穴，作用力1.5 N，频率60次/分钟，双侧同时施术，干预5分钟；随后食、中、无名三指松振法作用于中脘穴至关元穴的任脉区域，作用力1 N，频率200次/分钟，各干预5分钟。每次腹部推拿干预时间总计15分钟。

空白组及模型组在推拿组手法干预时段，给予同样时长及力度的抓取固定。

1.5 指标检测

1.5.1 外周血Lac、BUN及CK含量 各组大鼠在末次干预结束后禁食不禁水12小时，以6 mL/kg的剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，腹主动脉取血，在EP管中室温静置1.5小时，以3 000 r/分钟离心10分钟，取上清液，以全自动生化分析仪对各组血清样本进行相关指标检测。

1.5.2 PBMCs中pAMPK、AMPK、PGC-1α、caspase-3、TNF-α及IL-1β蛋白表达水平 以蛋白免疫印迹法进行检测。每组随机取3只大鼠的外周血清样本并分离PBMCs，对分离后的PBMCs用含有蛋白酶抑制剂的裂解液进行裂解(50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4，1 mm EDTA pH 8.0，250 mm NaCl，1% Triton-X)。

蛋白裂解液浓度利用Bradford法进行测量。10 μg从PBMCs细胞中获得的细胞裂解液与5×样品缓冲液(15 g SDS，15.6 mL 2M Tris pH 6.8，57.5 g glycerol，16.6 mL β-mercaptoethanol)混合后，将样品上样至10%聚丙烯酰胺凝胶中，SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上。用含0.1%吐温的4%牛奶进行封闭后，加入以下抗体，4℃孵育过夜。用含0.1%吐温的PBS溶液将膜洗3遍后，加入含0.1%吐温的4%牛奶以及HRP二抗在室温条件下孵育1小时。取出膜，在膜上滴加ECL显影液并放入MiniChemi成像系统进行拍照。Image J软件进行光密度分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 推拿对EF大鼠外周血疲劳相关代谢产物的影响

与空白组比较，模型组外周血中Lac、BUN、CK水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，推拿组外周血中的Lac、BUN及CK水平显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组EF大鼠外周血Lac、BUN、CK水平比较

2.2 推拿对EF大鼠PBMCs线粒体能量代谢及凋亡关键因子的影响

与空白组比较，模型组PBMCs中的pAMPK/AMPK及PGC-1α蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，推拿组PBMCs中的pAMPK/AMPK及PGC-1α蛋白表达水平显著升高(P<0.05，P<0.01)，caspase-3蛋白表达水平出现下降趋势。见表2、图1。

表2 各组EF大鼠PBMCs中pAMPK/AMPK比值、 PGC-1α、caspase-3表达水平比较

图1 各组EF大鼠PBMCs中AMPK、pAMPK、PGC-1α、

2.3 推拿对EF大鼠PBMCs中炎性因子水平的影响

与空白组比较，模型组PBMCs中的TNF-α及IL-1β水平显著上调(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，推拿组PBMCs中的TNF-α及IL-1β水平显著下调(P<0.05，P<0.01)。见表3、图1。

表3 各组EF大鼠PBMCs中TNF-α、IL-1β水平比较

dP<0.01。

3 讨论

EF归属于中医学“虚劳”范畴，病机为气血不足，痰浊内生。本团队在长期临床实践中发现此病的治疗应予以攻补兼施之法，由于脾主肌肉，为后天之本、气血生化之源，在治疗过程中既要通过手法加速“瘀浊”代谢，同时更要重视补益脾胃之气。因此，临床治疗不仅是在疲劳的肌肉局部施术，更应注重腹部手法施术。腹部推拿不仅具有健脾化浊的功效，同时兼顾培补元气，在临床上亦取得了显著的疗效[5-6]。

本次研究精简了临床处方，选取“天枢、中脘、关元”三个具备临床核心治疗思路的代表性腧穴，在控制变量的基础上，最大程度还原了腹部推拿的治疗思路。结果显示，腹部推拿后EF模型大鼠外周血中Lac、BUN及CK等疲劳代谢产物的水平显著下降，说明单纯腹部推拿干预同样具有较好的抗疲劳效果。天枢、关元、中脘三穴分别为大肠、小肠、胃之腹募穴，合而用之具有传导糟粕、泌别清浊及化生气血的功能，配合松振法及揉法寓通于补的手法特性，能够更好地将腧穴的功效发挥出来[7]。从解剖角度来看，天枢穴毗邻肾脏于腹部的体表投影，中脘、关元下方为腹主动脉，通过手法干预可加速血液循环与水液代谢，在保证能量供给的同时促使代谢废物清除，从而保护心、肝、肾等脏器功能。

研究表明，中等强度运动可以增强免疫系统功能，而超量运动则会引起分泌型免疫球蛋白A、干扰素等免疫分子的水平下降，从而促进运动性免疫抑制的出现[8]。EF可伴有单核巨噬细胞和自然杀伤细胞数量减少，中性淋巴细胞功能减退，引起机体炎症水平升高，进而导致糖皮质激素、血管紧张素、促肾上腺皮质激素、白细胞介素和肿瘤坏死因子数量降低，淋巴细胞数量减少，最后发生脾和胸腺免疫器官的萎缩与结构异常[9-10]。长期的EF状态可使一过性的免疫抑制发展为慢性免疫力低下，最终使机体整体患病率上升，违背了“强身健体”的初衷。根据团队前期的研究发现，推拿可改善EF导致的PBMCs凋亡比率升高及细胞功能障碍，可能是其减轻运动性免疫抑制，增强免疫系统功能的部分生物学机制[11]。因此，本次研究旨在明确推拿是否通过AMPK/PGC-1α/caspase-3信号途径实现了对EF大鼠PBMCs的凋亡抑制作用，并改善了PBMCs的炎症状态。

结果显示，腹部推拿干预后大鼠PBMCs的pAMPK/AMPK和PGC-1α蛋白表达水平显著下降。AMPK既是细胞能量代谢的“开关”，又是维持线粒体稳态的关键因子[12]，PGC-1α是线粒体生物合成的直接调控因子[13]。实验结果说明腹部推拿或可改善PBMCs的整体能量代谢水平，促进线粒体的生物合成。caspase-3表达水平在推拿后虽没有显著差异，但呈现出了一定下降趋势，提示caspase-3的mRNA转录速率或蛋白降解速率发生了一定程度的衰减，但也不排除推拿不依赖caspase-3途径抑制凋亡的可能，具体原因可通过延长干预时间及添加对基因转录情况的检测进行完善。炎性因子IL-1β及TNF-α表达水平的显著下调说明腹部推拿可以减轻EF状态下机体广泛氧化应激反应引起的PBMCs内免疫炎性反应，从而间接缓解PBMCs凋亡。已有研究发现线粒体功能障碍后释放的活性氧可激活NLRP3炎性体，表明线粒体不仅调控着细胞凋亡，同时也在细胞炎症反应中发挥着重要作用[14]。因此，腹部推拿可通过恢复PBMCs线粒体功能及生物合成，改善了PBMCs炎症水平。

本次研究虽然初步明确了AMPK/PGC-1α信号链参与了推拿抗凋亡及炎症效应的形成，但由于缺少抑制剂组，并未阐明该通路是否为实现手法效应关键环节。其次，本次研究中推拿调控casapase-3等凋亡关键信号分子的影响尚未明确，对推拿手法抗凋亡的作用途径有待进一步研究。最后，由于本次研究的结果提示线粒体或是推拿手法作用的关键靶细胞器，日后围绕线粒体生物合成及能量代谢关键信号通路开展研究也将有助于进一步揭示推拿改善运动性氧化应激及免疫抑制的生物学机制。