申开泽 万庆家 王 艳 刘 莎 张应龙 熊 宇

（1昭通学院农学与生命科学学院，云南昭通 657000；2云南万绿生物股份有限公司，云南玉溪 653300）

许多传统中药材具有多途径、多靶点、多层次增强免疫的优势，是开发增强免疫功能产品的重要原料[1]。 沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）主产于我国四川、陕西、甘肃、宁夏、山西等地，多以果实入药，中医认为其具有益气生津、祛痰止咳、消食止泻、活血散瘀等功效[2]。现代研究表明，沙棘富含黄酮类、萜类、甾体类、蛋白质和氨基酸类、有机酸类、多糖等成分，具有药食两用的价值[3]。沙棘在增强免疫力方面的功效已通过大量动物试验研究证实[2-5]。最近的研究表明，沙棘多糖和果油是其发挥增强免疫功能的关键成分[6-7]。库拉索芦荟（Aloe vera L.）主要含多糖等功能成分，具有较好的增强免疫力作用[8-11]。三七（Panax notoginseng）中的总皂苷可从增强细胞免疫、增强体液免疫和自然杀伤细胞功能等多方面、多靶点调节机体免疫功能[12-17]。本研究拟以沙棘果粉、库拉索芦荟提取物、三七提取物为主要原料开发复配产品，并对其进行增强免疫力功能验证。

1 材料与方法

1.1 试验样品

沙棘果粉，由高原圣果沙棘制品有限公司提供；库拉索芦荟提取物（100∶1），由云南万绿生物股份有限公司提供；三七提取物（三七总皂苷≥75%），由云南三七科技有限公司提供。3种功能原料复配结晶果糖、低聚果糖、三氯蔗糖和甜橙果粉等辅料制成沙棘、芦荟、三七复配物，人体质量按60 kg计，口服推荐量为每日1次，每次7.5 g（含沙棘果粉1.5 g、库拉索芦荟提取物1 g、三七总皂苷0.07 g），折合剂量为0.125 g/kg BW。

1.2 试验小鼠

采用体质量为18～22 g的SPF级ICR雌性小鼠共200只进行试验，小鼠购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。试验期间的动物生存环境温度为20～25℃，相对湿度为54%～58%。

1.3 主要仪器与试剂

1.3.1 主要仪器。MS-TS分析天平（梅特勒-托利多国际有限公司）；BBS-SDC洁净工作台（山东博科科学仪器有限公司）；离心机、Multiskan FC酶标仪、二氧化碳培养箱（赛默飞世尔公司）；722S分光光度计（梅特勒-托利多国际有限公司）；显微镜（上海点应光学仪器有限公司）。

1.3.2 试剂。绵羊红细胞（SRBC）（北京博尔西科技有限公司）；生理盐水（上海百特医疗用品有限公司）；Hank′s液（武汉卡诺斯科技有限公司）；RPMI1640 培养液（武汉普诺赛公司）；青链霉素（赛默飞世尔公司），ConA、Giemsa染液（美国 Sigma公司）；小牛血清（北京百奥莱博公司）；1%冰醋酸、1 mol/L的HCl溶液、0.1%的碳酸钠、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS缓冲液）（pH 值为 7.2～7.4），0.2 mol/L 的 Tris-HCl缓冲液（实验室配制）；SA缓冲液、鸡红细胞、补体（豚鼠血清）、MTT、YAC-1 细胞、都氏试剂、琼脂糖、2.5%Triton（上海源叶生物科技有限公司）；酸性异丙醇、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、甲醇（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；印度墨汁（上海哈灵生物科技有限公司）。

1.4 样品剂量选择和前处理

按人体推荐量的5倍、10倍和30倍设低、中、高3 个剂量组，即 0.625、l.250、3.750 g/kg BW。分别取复配物 6.25、12.5、37.5 g，用蒸馏水配制至 200 mL。

1.5 试验方法

将小鼠平均分为5个大组（每组40只），第一组开展碳廓清试验；第二组采用MTT法开展ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验、NK细胞的活性测试；第三组开展脏体比值、半数溶血值（HC50）和抗体生成细胞数测定；第四组采用足跖肿胀法进行迟发型变态反应（delayed type hypersensitivity，DTH）试验；第五组开展小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。每个大组随机分为4个小组（每组10只），即低、中、高3个剂量组和1个空白对照组（CK）。各小组按照20 mL/kg BW对小鼠进行灌胃，对照组用等量的蒸馏水，每日1次，持续30 d。数据转化和统计分析采用Excel、SPSS软件进行。

2 结果与分析

2.1 复配物对小鼠体质量的影响

与对照组相比，每个大组中的各剂量组小鼠在试验初期、中期和末期的体质量及试验期间的体质量变化均无显著性差异（P＞0.05），说明复配物对试验动物体质量及增长无明显影响。

2.2 复配物对小鼠免疫器官脏器与体质量比值的影响

各剂量组的小鼠胸腺与体质量比值和脾脏与体质量比值均与对照组无显著性差异（P＞0.05），说明受试物对试验动物的免疫器官脏器与体质量比值无明显影响（表1）。

表1 复配物对小鼠免疫器官脏器与体质量比值的影响

2.3 复配物对小鼠细胞免疫功能的影响

采用足跖肿胀法进行小鼠迟发型变态反应能力测试。用药24 h后，1.250 g/kg BW与3.750 g/kg BW剂量组的小鼠足跖肿胀度均与对照组有显著性差异（P＜0.05），表明样品能增强小鼠的细胞免疫。但采用MTT法开展ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验表明，各剂量组对淋巴细胞增殖能力（用OD差值表示）无显著性影响（P＞0.05）（表 2）。

表2 复配物对小鼠迟发型变态反应和淋巴细胞增殖能力的影响

2.4 复配物对小鼠体液免疫的影响

小鼠抗体生成细胞数检测采用Jerne玻片改良法。结果显示，1.250 g/kg BW和3.750 g/kg BW剂量组的溶血空斑数与对照组有显著性差异（P＜0.05）；3.750 g/kg BW剂量能显著提高小鼠的半数溶血值（HC50）（P＜0.05）。 试验综合表明，复配物能显著增强试验小鼠的体液免疫（表3）。

表3 复配物对小鼠抗体生成细胞数和半数溶血值的影响

2.5 复配物对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

在小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能影响试验中，以吞噬指数（a）来表示复配物的碳廓清能力。结果表明，复配物各剂量组吞噬指数统计均与对照组无显著性差异（P＞0.05）。在小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验中，各剂量组的吞噬率和吞噬指数与对照组无显著性差异（P＞0.05）（表 4）。

表4 复配物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清及巨噬细胞对鸡红细胞吞噬率的影响

2.6 复配物对小鼠NK细胞活性的影响

各剂量组小鼠NK细胞活性均高于对照组，并随剂量增高呈一定的递增关系，而且1.250 g/kg BW和3.750 g/kg BW剂量组均与对照组有显著性差异（P＜0.05）（表 5）。 由此可知，复配物能显著提高小鼠NK细胞活性。

表5 复配物对小鼠NK细胞活性的影响

3 结论与讨论

本研究全面评价了沙棘、芦荟、三七复配物对小鼠免疫力的影响。结果表明，与阴性对照组比较，连续30 d每天 1次经口灌胃给予小鼠 0.625、1.250、3.750 g/kg BW剂量，该复配物对小鼠体质量增长、胸腺与体质量比值、脾脏与体质量比值无显著影响，1.250、3.750 g/kg BW剂量能显著提高小鼠迟发型变态反应能力、NK细胞活性以及抗体生成细胞数，3.750 g/kg BW剂量能显著提高小鼠半数溶血值。可以看出，沙棘、芦荟、三七复配物具有增强免疫力的功能。本研究为以沙棘、库拉索芦荟和三七为功能原料进行增强免疫力功能保健食品的开发提供了试验和理论基础。鉴于本研究只采用动物试验进行了初步的功能验证，未进行相关产品的开发，后续还应尽量开展多中心、大样本的随机对照人体试食研究，以进一步论证其功能。