裴徐梨 胡文婷 荆赞革 焦鹏 朱丽瑞 宋立晓 严继勇

摘要： 蔗糖轉化酶（ INV ）编码基因广泛参与植物的生长发育，在果实成熟期可影响果实品质。本研究利用生物信息学手段对中国南瓜 INV 基因家族进行鉴定和分析。结果表明，从中国南瓜中鉴定出18个 INV 基因家族成员，其功能分为酸性转化酶和中性/碱性转化酶两大类。该家族成员在11条染色体上不均匀分布，且仅有1对串联重复基因。表达模式分析结果显示，CmoCh06G004890.1在根中的相对表达量高于其他 INV 基因家族成员，CmoCh01G010160.1和CmoCh06G004890.1在果实中的相对表达量较高。葫芦科作物 INV 系统进化分析结果表明，中国南瓜、印度南瓜和美洲南瓜的大多数 INV 基因均聚为一簇，具有较近的亲缘关系。本研究结果为进一步分析中国南瓜 INV 基因的生物学功能以及提高中国南瓜品质提供了一定的理论依据。

关键词： 中国南瓜;  INV 基因; 序列特征; 进化分析

中图分类号： S642.1   文献标识码： A   文章编号： 1000-4440（2022）03-0782-08

Analysis on identification， evolution and expression of sucrose invertase gene （ INV ） in  Cucurbita moschata

PEI Xu-li 1 ， HU Wen-ting 1 ， JING Zan-ge 1 ， JIAO Peng 1 ， ZHU Li-rui 1 ， SONG Li-xiao 2 ， YAN Ji-yong 3

（1.College of Agronomy and Life Sciences， Kunming University， Kunming 650214， China; 2.Institute of Agricultural Resources and Environment， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China; 3.Institute of Vegetable Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： Invertase （ INV ） encoding genes are widely involved in plant growth and development， and can affect fruit quality during ripening stage. In this study，  INV  gene family of  Cucurbita moschata  was identified and analyzed by bioinformatic methods. The results showed that， 18 members of  INV  gene family were identified from  C. moschata ， and their corresponding functions were encoding acid  INV  and neutral/alkaline  INV . The members of  INV  gene family distributed unevenly on 11 chromosomes and there only existed one pair of tandem duplicated genes. Analysis of expression pattern showed that， the relative expression level of CmoCh06G004890.1 in roots of  C. moschata  was higher than other members of  INV  gene family. The relative expression levels of CmoCh01G010160.1 and CmoCh06G004890.1 were relatively high in fruits of  C. moschata . Results of phylogenetic analysis of  INV  genes in Cucurbitaceae crops showed that， Most of the  INV  genes from  C.moschata ，  C.maxima  and  C. pepo  gathered into one cluster and had close genetic relationships. The results can provide theoretical basis for further analyzing of the biological functions of  INV  genes and improving fruit quality of  C. moschata .

Key words：  Cucurbita moschata ; invertase （ INV ） gene; sequence characteristics; evolutionary analysis

蔗糖转化酶（ INV ） 是高等植物蔗糖代谢的关键酶类，与葡萄糖和果糖的水解有重要关系。按照 INV 亚细胞定位与最适pH的分类标准，可将其分为细胞质转化酶（ CIN ） 、液泡转化酶（ VIN ） 和细胞壁转化酶（ CWIN ） 3种类型。液泡转化酶和细胞壁转化酶属于酸性蔗糖转化酶，细胞质转化酶属于中性或碱性蔗糖转化酶 [1] 。

大量研究结果表明，蔗糖转化酶在植物生长发育、果实成熟、糖分平衡及非生物胁迫等方面具有重要作用。目前，已在水稻、番茄、辣椒等作物中克隆得到蔗糖转化酶基因 [2-4] 。在甘薯中， CIN 和 VIN 是调控块根中己糖含量的关键酶类 [5] 。酸性转化酶不仅在甜瓜果实的发育中起重要作用，还控制甜瓜果实中蔗糖的含量 [6] 。植物缺失蔗糖转化酶会造成生长缺陷，且不能完全通过外源加入的己糖来弥补 [7] 。Tang等 [8] 通过沉默GmCIF1表达，使 CWIN 通过调控蔗糖代谢等途径来协调大豆种子的成熟。Qian等 [9] 对茶树蔗糖转化酶基因进行分析发现，这些基因均参与调节茶树生长和发育以及对各种非生物胁迫的响应。

中国南瓜（ Cucurbita moschata ） 属葫芦科南瓜属植物，其果实中富含淀粉等糖类物质，糖类物质含量直接影响中国南瓜果实风味和口感。本研究以中国南瓜蔗糖转化酶为研究对象，通过生物信息学方法，鉴定该基因家族的数目和理化性质，同时分析 INV 蛋白质基序结构、系统进化和表达模式。本研究结果可为进一步分析中国南瓜 INV 基因的生物学功能以及提高中国南瓜品质提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 中国南瓜 INV 基因家族的成员鉴定

以拟南芥蔗糖转化酶 INV 基因家族的氨基酸序列为种子序列在中国南瓜基因组数据库（http：//cucurbitgenomics.org/organism/9） 中检索 INV 基因（ E-vaule <10 -5 ） 。同時从Pfam网站（http：//pfam.xfam.org/）下载 INV 基因的隐马尔可夫模型进行全基因组检索。利用Pfam网站验证以上2种方法获取的候选基因是否含有该家族保守结构域 [10] 。

1.2 中国南瓜 INV 基因家族序列特征分析

利用ProtParam tool （https：//web.expasy.org/protparam/） 对中国南瓜 INV 基因序列的相对分子质量、氨基酸数量、等电点、稳定性系数、亲疏水性等进行分析 [11] 。对鉴定出的中国南瓜 INV 基因家族成员利用GSDS软件分析其基因结构。利用MEME （http：//meme-suite.org/tools/meme） 在线软件分析 INV 蛋白的保守域和结构元件（最大元件参数数量设置为10个，最佳宽度的元件数量设置为6～ 50个） 。使用Web CD-Search Tool （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi） 进行保守结构域分析。利用TBtools软件进行图形可视化。

1.3 中国南瓜 INV 基因家族的表达模式分析

从CuGenDB数据库中下载中国南瓜不同组织器官（包括根、茎、叶、果实）的转录组数据。利用TBtools分析 INV 基因的表达情况，并绘制热图。

1.4 葫芦科 INV 基因家族的系统进化分析

参照方法1.1，从印度南瓜、美洲南瓜、西瓜、黄瓜、冬瓜和葫芦等物种中鉴定出 INV 基因家族成员，使用MEGA 6.0的邻接法构建系统进化树。相关参数设置为：Bootstrap method 1 000，Poisson model，Partial deletion 95，其余参数为默认值。

2 结果与分析

2.1 中国南瓜 INV 基因家族的鉴定

根据检索结果和保守结构域验证结果，最终鉴定到18个南瓜 INV 基因家族成员，其中，11个为酸性蔗糖转化酶成员，7个为中性或碱性蔗糖转化酶成员。染色体定位分析发现，仅1对为串联重复基因。其中，5个 INV 基因家族成员（CmoCh17G004560.1、CmoCh17G004570.1、CmoCh17G004620.1、C￣m￣o￣C￣h￣1￣7￣G￣0￣0￣6￣9￣1￣0￣.1和CmoCh17G006930.1）分布在第17号染色体上。此外，除1号、14号、15号染色体有2个成员外，其余染色体上仅有1个成员（图1、表1） 。

2.2 中国南瓜 INV 基因家族的序列特征分析

中国南瓜 INV 基因家族的CDS序列长度为1 299～ 2 889  bp，氨基酸长度为432～ 962 aa。其中，基因序列最长的为CmoCh14G003190.1，最短的为CmoCh17G004570.1 （表1） 。

通过绘制中国南瓜 INV 基因家族的内含子-外显子结构（图2），发现该基因家族的基因结构差异较大。CmoCh14G003190.1基因的内含子和外显子数均较高，分别为13和14个。7个 INV 基因（CmoCh17G004620.1、CmoCh06G004890.1、C￣m￣o￣C￣h￣1￣7￣G￣0￣0￣6￣910.1、CmoCh01G017810.1、CmoCh15G014910.1、CmoCh04G014980.1、CmoCh14G016100.1） 具有6个内含子，而CmoCh01G010160.1和￣C￣m￣o￣C￣h￣0￣9￣G￣0￣1￣1￣190.1仅包含3～ 4个内含子。

2.3 中国南瓜 INV 基因家族的理化性质分析

理化性质分析结果表明，中国南瓜 INV 基因家族蛋白质相对分子质量为48 469～ 107 835 ，等电点为5.12～ 9.29，8个 INV 基因编码的蛋白质具有跨膜结构域，亚细胞定位显示INV蛋白位于细胞壁、液泡或叶绿体，平均亲水性为-0.461～ -0.071 ，均为亲水性蛋白质（表1） 。

2.4 中国南瓜 INV 基因家族的表达模式分析

分析中国南瓜 INV 基因家族成员在不同器官中的表达情况，结果显示，18个 INV 基因在中国南瓜的根、茎尖、叶和果实中均表达（图3） 。CmoCh01G010160.1和C￣m￣o￣C￣h￣0￣6￣G￣0￣0￣4890.1在果实中的相对表达量较高，CmoCh06G004890.1在根中的表达量均高于其他基因家族成员， CmoCh17G006930.1和CmoCh04G014980.1在叶片中的相对表达量相对较高。5个基因家族成员（CmoCh17G004560.1、C￣m￣o￣C￣h￣1￣7￣G￣0￣0￣4620.1、CmoCh17G004570.1、CmoCh05G001000.1、CmoCh15G012070.1）在不同器官中的相对表达量均较低 （图3） 。

2.5 葫芦科 INV 基因家族的系统进化树分析

使用MEGA软件构建18个中国南瓜 INV 基因成员的进化树（图4） ，结果将 INV 基因家族按编码物质分为中性/碱性转化酶和酸性转化酶两大类。 INV  Ⅰ大类编码酸性转化酶，分为2个分支，其中1个分支的成员（CmoCh15G012070.1和CmoCh15G014910.1）编码液泡转化酶（ VIN ） ，另一分支中的9个成员均编码细胞壁转化酶（ CWIN）  。 INV  Ⅱ大类编码中性/碱性转化酶，均为细胞质转化酶（ CIN）  ，其中CmoCh18G009420.1和CmoCh04G014980.1、CmoCh14G016100.1和CmoCh12G010220.1分别位于1个单独的分支。

为明确葫芦科植物之间 INV 基因家族成员的亲缘关系，将鉴定到的中国南瓜的18个、印度南瓜 （ Cucurbita maxima ） 的22个、美洲南瓜（ Cucurbita pepo ）的19个、西瓜（ Citrullus lanatus ）的12個、甜瓜（ Cucumis melo ） 的12个、黄瓜（ Cucumis sativus ） 的13个、冬瓜（ Benincasa hispida ） 的11个、葫芦（ Lagenaria siceraria ） 的12个 INV 基因家族成员进行系统进化树构建，结果（图5）表明，胡芦科 INV 基因家族在进化树中分为2支。分支Ⅰ编码酸性转化酶，分支Ⅱ编码中性/碱性转化酶。中国南瓜、印度南瓜和美洲南瓜的大多数 INV 基因均聚为一簇，黄瓜与甜瓜的 INV 基因在进化树中也较常聚为一类，如CsaV33G015320.1和MELO3C006727T1，具有较近的亲缘关系。西瓜与葫芦的部分基因如Cla97C05G099220.1和Lsi045014210.1等，都具有非常高的同源性。利用最大似然法构建系统进化树，也表现出类似的结果。

3 讨 论

INV 基因是参与植物体形态建成和生长发育的关键蔗糖代谢酶编码基因，是碳水化合物代谢的关键构成部分。 INV 基因家族在不同植物中拥有不同的成员数量，目前在拟南芥、葡萄和水稻中均已鉴定到8个，草莓中鉴定到9个，杨树中鉴定到16个。本研究通过生物信息学方法共鉴定到18个南瓜 INV 基因，其中7个为蔗糖中性/碱性转化酶成员，11个为酸性转化酶成员。

基因的理化性质研究对基因功能研究具有重要作用。苗小荣等 [12] 研究发现，铁皮石斛的中性/碱性转化酶（DoNI2） 的等电点为6.38，疏水性的平均值为-0.232，预测为亲水性蛋白质，预测亚细胞定位在线粒体上。阳江华等 [13] 在橡胶中进行 INV 亚细胞定位预测，结果表明，碱性转化酶（HbNIN8） 定位在叶绿体上。本研究结果与前人研究结果相似，鉴定到的7个南瓜中性/碱性转化酶和11个酸性转化酶的平均等电点分别为6.16和7.43，平均疏水性分别为-0.191和-0.316，均为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示，酸性转化酶定位于细胞壁和液泡上，中性/碱性转化酶定位于叶绿体上，但精确定位还需要进一步验证。

前人在分析棉花 INV 成员的系统进化关系时将棉花 INV 基因家族分为中性/碱性转化酶和酸性转化酶2个大亚族，其中第1个大亚族又可分为2个小亚族 [14] 。王海波等 [15] 将鉴定到的16个小桐子 INV 基因家族成员聚类为两大家族3个亚家族。同样，本研究通过进化树分析将中国南瓜18个 INV 基因分为两大类，即中性/碱性转化酶编码基因和酸性转化酶编码基因。进一步对葫芦科 INV 基因家族成员的进化分析发现，美洲南瓜、印度南瓜和中国南瓜的 INV 基因家族成员同源性最高，葫芦和西瓜的 INV 基因家族成员同源性较高。此外，吴晓慧等 [16] 研究发现木薯转化酶相关基因家族的保守性较高，帅良等 [17] 研究发现龙眼中3个中性转化酶的氨基酸序列高度保守，且都有2个催化残基。本研究通过对中国南瓜 INV 基因家族的序列和结构分析发现，各 INV 基因成员的保守度高，这一点与前人的结论基本符合。

蔗糖转化酶可通过不可逆降解葡萄糖和果糖而影响果实糖分积累，进而影响果品质量 [18] 。同为葫芦科植物的甜瓜嫁接后，发育阶段的功能性叶片中酸性转化酶和中性/碱性蔗糖转化酶的活性增加，后期蔗糖磷酸合成酶和水苏糖合成酶活性提高，从而显著促进叶片中糖类物质向果实的转移 [19] 。中性/碱性蔗糖转化酶活性在大多数蔗糖贮藏型植物的未成熟果实中较高，随着果实成熟其活性逐渐降低 [20] 。前人研究发现，甜橙和甜瓜在果实成熟过程中酸性转化酶含量逐渐降低，蔗糖含量逐渐增加 [21-22] 。郭利军等 [23] 在研究中发现，在芒果不同发育阶段，中性/碱性转化酶的表达量差异较大，开花后10～ 40 d，果肉中表达量为0.028 9 。当果实完全成熟时，果肉中中性/碱性转化酶表达水平降低，只有0.000 7 。本研究发现多个 INV 基因在果实中的表达量较低，推测这些基因在中国南瓜果实成熟过程中具有重要的作用。

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（责任编辑：陈海霞）

收稿日期：2021-08-07

基金项目：昆明学院引进人才科研项目 （YJL19009）;云南省教育厅科学研究基金项目 （2021Y717、2021Y721）

作者简介：裴徐梨（1990-），女，云南个旧人，博士，讲师，研究方向为蔬菜分子生物学。（E-mail）xuliP1990@163.com

通讯作者：宋立晓，（E-mail）56785633@qq.com