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糙皮侧耳与黄孢原毛平革菌发酵处理花生秧对其养分含量及奶牛瘤胃降解特性的影响

2022-07-16王阔鹏晏琦程志强吉慧敏魏元浩林淼

江苏农业学报 2022年3期

王阔鹏 晏琦 程志强 吉慧敏 魏元浩 林淼

摘要: 本研究旨在研究2種白腐真菌及其组合预处理花生秧的效果。选取单菌株糙皮侧耳 (Pleurotus ostreatus ) (Po)、黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium) (Pc)和组合菌株(PoPc)处理花生秧,并设置对照组花生秧(CK1)、灭菌花生秧(CK2)测定发酵后10 d、20 d和30 d养分含量变化。利用尼龙袋法评定其粗蛋白质( CP)、干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF) 和酸性洗涤纤维(ADF)的 72 h瘤胃动态降解率和有效降解率。结果表明,(1)Po处理花生秧30 d时CP含量显著增加( P < 0.05)。Pc和PoPc处理30 d花生秧的粗蛋白含量、粗灰分含量差异不显著( P > 0.05),2种真菌的组合存在拮抗作用,降解木质素效果小于单一菌株。(2)Po处理NDF、ADF瘤胃有效降解率显著高于Pc处理和PoPc处理( P < 0.05),DM瘤胃有效降解率显著低于Pc处理和PoPc处理( P < 0.05)。3种真菌预处理方式同CK1相比未显著改变CP有效降解率。 综上,与Pc处理和PoPc处理相比,Po处理花生秧提高了CP含量,减少了其他可利用碳水化合物在发酵过程中的损失;Po具有提高花生秧营养价值的潜力。

关键词: 花生秧; 糙皮侧耳; 黄孢原毛平革菌; 瘤胃降解率; 养分含量

中图分类号: S816.6   文献标识码: A   文章编号: 1000-4440(2022)03-0756-09

Effects of fermentation treatment of peanut vine with  Pleurotus ostreatus  and  Phanerochaete chrysosporium  on nutrient content and rumen degradation characteristics of dairy cows

WANG Kuo-peng, YAN Qi, CHENG Zhi-qiang, JI Hui-min, WEI Yuan-hao, LIN Miao

(College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Abstract: This experiment was conducted to investigate the effects of two white rot fungi and their combination on the pretreatment of peanut vine. A single strain of  Pleurotus ostreatus  (Po),  Phanerochaete chrysosporium  (PC) and a combination strain (PoPC) were selected to treat peanut vine, and control peanut vine (CK1) and sterilized peanut vine (CK2) were set to determine the changes of nutrient contents at 10 d, 20 d and 30 d after fermentation. The dynamic degradation rates and effective degradation rates of dry matter (DM), crude protein (CP), neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) at 72 h were evaluated by nylon bag method. The results showed that the crude protein content of peanut vine pretreated with Po for 30 d increased significant ( P < 0.05). The crude protein content and crude ash content of peanut vine pretreated by Pc and PoPc for 30 days had no significant difference ( P > 0.05). The combination of the two fungi had antagonistic effect, and the lignin degradation effect was less than that of single strain. The rumen effective degradation rate of NDF and ADF in Po treatment was significantly higher than that in Pc and PoPc treatments ( P < 0.05), and the rumen effective degradation rate of DM in Po treatment was significantly lower than that in Pc and PoPc treatments ( P < 0.05). The three fungal pretreatment methods did not significantly change the effective degradation rate of CP compared with CK1. In conclusion, compared with Pc and PoPc, Po pretreatment of peanut vine increased CP content and reduced the loss of other available carbohydrates during fermentation. Po has the potential to improve the nutritional value of peanut vine.

Key words: peanut vine;  Pleurotus ostreatus ;  Phanerochaete chrysosporium ; rumen degradation rate; nutrient content

中国农作物秸秆每年的理论产量约为9.0× 10 8  t,秸秆综合利用率达到80.1%,其中饲料化利用占比仅为 18.8% [1]  。秸秆中细胞壁的主要成分为半纤维素、纤维素和木质素 [2] ,瘤胃不降解木质素,半纤维素、纤维素与木质素通过共价键、醚键和酯键等方式结合,阻碍纤维素酶的水解及瘤胃中的微生物利用 [3-4] 。采用预处理方式破坏秸秆木质素结构,使瘤胃微生物及消化酶能够更加容易接触到纤维素,达到提高秸秆的饲料利用率的目的 [5] 。目前生物法是预处理秸秆的主要方式之一,利用微生物发酵或酶解等方式使秸秆中的营养物质被吸收转化,进而生产出富含菌体蛋白、维生素等成分的生物饲料,解决了难消化的粗纤维转化为可消化养分的难题,但其缺点是作用效果往往会受到工艺条件的影响 [6] 。芽孢杆菌属细菌、木霉属真菌 [7-8] 及白腐真菌 [9-10] 是常用的可降解木质纤维素的菌种,可用于生产高品质的发酵粗饲料。降解木质素的真菌主要有白腐菌、褐腐菌、软腐菌 3 类,其中只有白腐菌能独立降解木质素 [11] 。

花生在中国油料生产中种植面积仅次于油菜,居第二位,2019年中国花生种植面积为4.633× 10 6  hm2 [12] 。花生种植面积的扩大产生了大量花生秧。随着中国奶牛规模化养殖的发展,对优质粗饲料的需求量也迅猛增加,深入研究花生秧预处理方法,用以代替苜蓿等牧草,成为亟待解决的问题。本研究以白腐真菌发酵花生秧为研究对象,通过测定花生秧在发酵过程中养分含量的变化,评价其降解木质素的特点和能力,通过尼龙袋法评价不同白腐真菌预处理花生秧在奶牛瘤胃中的降解率的差异,为提高花生秧的降解率及饲喂价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种及接种载体制备

本研究所用菌种为糙皮侧耳( Pleurotus ostreatus )和黄孢原毛平革菌( Phanerochaete chrysosporium ),由中国农业大学徐春城课题组赠予。2种真菌活化后接种到麦芽提取物培养基上,24 ℃恒温培养至菌丝铺满培养皿。称取粟米200 g,加热调制到水分含量为60%左右,105 ℃烘干米粒表面水分使其分散不黏连,装入聚丙烯发酵袋灭菌(121 ℃,20 min)。在超净台中分别接种上述2种白腐真菌至粟米中,24 ℃培养14 d,菌丝布满米粒表面后,置于4 ℃冰箱中保存,备用。

1.2 花生秧来源及处理

花生秧风干样于2020年10月取自河南省许昌市,使用前用铡刀切碎至2~ 3 cm,自来水浸泡过夜,最后将水分含量调制成78.2%。每袋200 g分装至聚丙烯菌袋(长37 cm×宽20 cm)中, 灭菌(121 ℃,20 min),超净台冷却备用。

1.3 接种及发酵

发酵试验共3个处理组,糙皮侧耳发酵处理花生秧(Po)、黄孢原毛平革菌发酵处理花生秧(Pc)及糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌复合发酵处理花生秧(PoPc),同时设置原料花生秧对照组(CK1)和花生秧灭菌对照组(CK2)。用无菌镊子向灭菌后花生秧中接种入2%(质量比)的长满菌丝的粟米粒,复合处理组糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌各接入1%的粟米粒 。将菌包放在温度为 24 ℃、相对湿度为 75%的培养箱中发酵。各组在发酵的第 0 d、10 d、20 d和30 d進行取样,每个处理每次随机取样 3个菌包,烘箱中65 ℃烘48 h,然后粉碎至可通过 2 mm的筛网,用于瘤胃尼龙袋试验。剩余部分用于相关指标测定,所有试验测定均设置3个重复。花生秧养分含量见表1。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 花生秧养分含量 干物质(DM)含量、粗蛋白(CP)含量、粗灰分(ASH)含量的测定参考张丽英 [13] 的方法测 定 ;CP 含 量 使 用FOSS 半自动 凯 氏 定 氮 仪测 定; 中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、木质素(ADL)含 量根据 Van Soest等 [14] 的方法使 用 ANKOM-2000I 全自动纤维分析仪测定。

1.4.2 养分含量损失率计算 养分含量损失率计算参考牛东泽 [15] 的方法:

DM 1 = (m 2 -m 1 )×DM 0 -(m 3 -m 1 )(m 2 -m 1 )×DM 0  ×100%

式中, DM 1 为样品发酵后干物质的损失率; m 1 培养袋质量; DM 0 为原样品的干物质含量;  m 2 为培养袋和未发酵样品鲜质量; m 3 培养袋和发酵样品干质量。

1.4.3 瘤胃降解率指标 本试验在扬州大学农牧场进行,选用3头体质状况良好、体质量(625± 25) kg、安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛,试验奶牛基础饲粮组成及饲喂方式参考王敬林等 [16]  的研究。称取被测样品3 g左右放入处理好的尼龙袋中,5个组每个时间点设置2 个平行,3 次重复。尼龙袋固定于塑胶管,按同时放入、依次取出原则 [17] ,分别在6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h后取出,冲洗干净,65 °C烘干,称质量并保存。

某时间点瘤胃降解率=(降解前养分含量-该时间点降解后养分含量)/降解前袋内养分含量×100%。

瘤胃动力学数学模型和有效降解率( ED )参照Orskov 等 [18] 的计算方法。某饲料营养成分实时瘤胃降解率( P )符合指数曲线:

P  = a + b  ( 1-e  -   ct  )

ED  = a + bc /( k + c )

式中, t 为瘤胃中饲料停留的时间(h); a 为快速降解部分(%); b 为慢速降解部分(%); c 为 b 的降解速率(%);  ED 为饲料营养物质的有效降解率(%); k 为瘤胃食糜外流速率,参考郑向丽等 [19] 的研究, k 取值为0.023 5 。

1.5 统计分析

采用Excel 2016和SPSS21.0对试验数据整理并进行双因素方差分析,采用单因素方法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理花生秧的养分含量变化

由表2可知,白腐真菌菌种和发酵时间的互作效应对花生秧的 NDF和 ADF含量均有极显著影响( P < 0.01),对木质素与灰分含量无显著影响( P > 0.05)。发酵时间的延长有利于提高发酵处理花生秧的粗蛋白含量,最大值出现在发酵30 d的Po组。另外,Po组发酵时间对发酵处理花生秧的NDF 和 ADF 含量无影响,但Pc、PoPc两组发酵时间与发酵处理花生秧 NDF 和 ADF 含量呈负相关( P < 0.01);Pc组对花生秧ADL降解效果最好,与发酵时间呈负相关( P < 0.05)。在发酵10 d、20 d和30 d时,这3个时间点Po组与Pc组、PoPc 2组粗灰分含量差异显著( P < 0.05),粗灰分含量随发酵时间的延长而增大( P < 0.05)。

2.2 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理花生秧的养分含量损失率

由表3 可知,白腐真菌菌种和发酵时间的互作效应对花生秧 DM、ADL和纤维素降解量均有极显著影响( P < 0.01)。Pc组和PoPc组的各养分损失率均与发酵时间呈正相关关系( P < 0.05)。随着发酵时间的延长,3个处理组的DM、ADL和NDF损失率均差异显著( P < 0.05)。Po组与Pc组和PoPc组DM损失率在各时间段均差异极显著( P < 0.01)。Po组的ADL在各时间段的损失率差异不显著( P > 0.05),但在发酵30 d时ADL损失率显著小于Pc组与PoPc组( P < 0.05); PoPc组30 d时NDF损失率显著高于其他2个处理组( P < 0.05);Pc组和PoPc组在发酵30 d 时花生秧纤维素和半纤维素损失率差异不显著( P > 0.05),但2个组纤维素和半纤维素损失率显著大于Po组( P < 0.05)。

2.3 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理的花生秧DM降解特性

由表4可知,CK1 72 h DM降解率高于其他各组( P < 0.05)。Pc组和PoPc组在6 h时DM降解率均高于其他组( P < 0.05),快速降解部分Pc组和PoPc组显著高于其他各组( P < 0.05);Po组在各时间点均低于其他各组( P < 0.05),CK2在各时间点(除12 h外)DM降解率显著低于CK1( P < 0.05);CK1与Pc组DM有效降解率高于PoPc组、CK2和Po组( P < 0.05)。

2.4 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理的花生秧NDF降解特性

由表5可知, CK1、CK2与Po组12 h NDF降解率差异不显著 ( P > 0.05);Pc组在6 h和12 h时NDF降解率显著高于PoPc 组( P < 0.05),12 h后这2组NDF降解率相似,且显著低于其他3组( P < 0.05);在24 h、36 h 时Po与 CK2两组NDF的降解率显著低于CK1( P < 0.05),且出现降解延滞期。CK1 NDF降解率在72 h时间点最高,但与Po、CK2两组差异不显著( P > 0.05)。Pc组的快速降解部分显著高于其他各组( P < 0.05);Pc组与PoPc两组的有效降解率低于Po组、CK1和CK2( P < 0.05)。

2.5 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理的花生秧ADF降解特性

由表6可知,36 h时CK1的ADF降解率显著高于CK2( P < 0.05),在其他时间点两者差异不显著,除6 h外,这两组在不同时间段均高于其他3组( P < 0.05)。Pc組和PoPc组各时间点ADF降解率相近,两组在72 h的ADF降解率极显著低于其他3组( P < 0.01)。Po组的潜在降解部分与CK1差异不显著( P >0.05);CK1与CK2两组在慢速降解部分均显著高于其他组( P < 0.05)。

2.6 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理的花生秧CP降解特性

由表7可知,在6 h和12 h时Pc组与PoPc组CP降解率无显著差异,均高于其他3组( P < 0.05),两组均在6 h后降解率平缓上升;各时间点Po组和CK1 CP降解率差异不显著( P > 0.05);CK2 CP降解率最低( P < 0.05);在12 h后,除CK2外,其他4组CP降解率相近。Pc组与PoPc组快速降解部分CP降解率高于其他各组( P < 0.05),两者无差异。Po组与CK1慢速降解部分CP降解率显著高于其他组( P < 0.05)。

3 讨 论

3.1 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理的花生秧养分变化

花生秧是一种优质的粗饲料,本研究中花生秧养分含量与前人报道结果相符 [19-20] 。白腐真菌对木质纤维素的降解程度取决于发酵底物的特性,其通过促进纤维素和半纤维素释放而改善瘤胃发酵能力来提高秸秆的营养价值 [21] 。在白腐真菌发酵过程中,秸秆中木质素的降解同时伴随着纤维素和半纤维素的降解,导致有机物损失严重 [22] 。本试验中,Pc组处理花生秧30 d后DM和ADL损失率分别为43.9%和63.6%,PoPc组处理花生秧30 d 后DM和ADL损失率(42.9%、61.9%)稍低于Pc组,表明2种真菌对花生秧的发酵无协同作用,与前人研究混合真菌发酵其他农作物秸秆的研究结果不同 [23-25] 。白腐真菌菌种和发酵天数的交互作用对花生秧ADL的含量变化影响不显著,与牛东泽 [15] 研究真菌发酵小麦秸秆的结论一致。白腐真菌在生长过程中能够产生菌体细胞蛋白质,本研究中花生秧发酵随着时间的增加CP含量增加。通常情况下,随着碳水化合物被降解为 CO2 和 H2 O,基质中 NDF 和 ADF 的含量出现下降 [26] ,本研究中Po处理花生秧后出现了NDF 和 ADF 的含量稍上升的结果,这一现象可能是由于其他组分(ADL)的损失造成NDF 与 ADF表观值升高,试验结果与Niu等 [3] 利用白腐真菌处理小麦秸秆后ADF含量变化的研究结果相同。本研究中Pc处理花生秧出现了较高的DM、纤维素和半纤维素损失率,说明该菌生长特点为非选择性降解纤维素、半纤维素和木质素 [21] 。因此,在本研究的试验条件下,该菌不是发酵饲用花生秧的最佳菌种。

3.2 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理的花生秧DM降解特性

DM 瘤胃降解率反映了有机物质在秸秆内的累积量 [27] 。DM 降解率受饲料原料品种、饲料粒度、日粮精粗比、奶牛所处泌乳阶段等因素影响 [28]  。农作物秸秆等粗饲料木质素含量高,秸秆在真菌发酵培养中,菌丝能够分泌纤维素酶及木质素降解酶,使细胞壁结构松散,木质素中的苯环被解链,使其松软,秸秆相对接触面积增大,有助瘤胃内微生物对底物的附着及消化,加快降解速率 [29] 。本研究中在瘤胃发酵前期Pc组12 h时DM 降解率为40.91%,而Po处理花生秧后干物质含量无大变化,DM有效降解率仅为25.1%。Po组有效降解率显著低于Pc组,原因可能为不同菌种发酵秸秆后产物不同,阻碍了瘤胃微生物对其消化利用,文江南等 [30] 利用平菇处理水稻秸秆,抑制了水稻秸秆的瘤胃纤维降解、挥发性脂肪酸生成。本研究中花生秧干物质的有效降解率为45.8%左右,稍低于前人研究结果 [31] 。

3.3 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理的花生秧NDF和ADF降解特性

纤维在瘤胃中的消化主要受木质素的影响,纤维素、半纤维素和木质素间形成的酯键、醚键等阻碍了微生物的附着,影响瘤胃对粗饲料的消化利用 [32] 。本研究中Pc和PoPc两组NDF与ADF有效降解率最低,且Po组显著高于这2个组。上述结果与干物质降解率恰好相反,原因可能是Pc处理后花生秧可溶性碳水化合物含量较高,并且Pc组和PoPc组预处理花生秧时消耗了过多的纤维性养分。本研究中5种花生秧NDF与ADF降解率在前12 h变化较小,12 h后降解率明显提高,至48 h后趋于平缓,结果与前人研究结果 [33] 基本一致。本研究中花生秧 NDF与ADF 的有效降解率为 23.36%和25.38%,与蔡阿敏等 [20] 报道的夏季花生秧NDF和ADF的有效降解率31.48%、30.64%,冯豆等 [34] 报道的花生秧NDF和ADF的有效降解率36.52%、34.07%以及刘艳芳等 [32] 报道的花生秧NDF和ADF的有效降解率27.01%、27.43%相比较低。王加启等 [35] 发现随着日粮精粗比的增加,NDF 与 ADF 的降解率均有不同程度的降低。

3.4 糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌发酵处理的花生秧CP降解特性

微生物处理秸秆,可利用秸秆将非蛋白质氮转化为自身菌体蛋白质,提高秸秆发酵物的蛋白质含量及消化率,将秸秆中粗纤维等降解为反刍动物容易消化吸收的单糖、双糖、氨基酸等小分子物质 [29] 。本研究中花生秧的CP有效降解率低于蔡阿敏等 [20] 、刘艳芳等 [32] 及冯豆等 [34] 研究的花生秧有效降解率,可能是由于奶牛个体与饲喂的全混合日粮(TMR)不同,使得瘤胃消化环境不同 [36] 。试验中Pc 组和PoPc组的CP的快速降解部分显著高于其他3组,苜蓿作为优质蛋白质来源,其降解率高且降解速率快,而本研究中Pc和PoPc处理花生秧CP的瘤胃快速降解部分为29.4%和29.9%,一级苜蓿的快速降解部分为31.7% [32] ,这说明花生秧经过真菌发酵后,其中的蛋白质更易消化。Po 组CP有效降解率与CK1、Pc 组和PoPc组差异不显著,但Po处理后的花生秧自身蛋白质含量提高,同未处理的花生秧相比,Po处理后瘤胃内降解蛋白质的当量也增加。CK2的CP有效降解率显著低于其他4组,其机制需要进一步研究。同种粗饲料用不同真菌处理, CP 含量高的在瘤胃中的降解率不一定高,只通过化学分析方法判断其营养价值具有单一性 [32] ,需要结合动物粗饲料采食量及瘤胃体外产气培养判断其可利用性。

4 结 论

3种发酵预处理方式中,Po预处理花生秧效果最好,可降低ADL含量并增加CP含量;干物质损失率最低(4.4%)。

通过瘤胃尼龙袋试验,糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌单独及混合预处理花生秧的瘤胃CP有效降解率与花生秧原料相近。但从总体营养成分上看,白腐真菌预处理提高了蛋白质价值,Po处理的花生秧NDF、ADF有效降解率显著高于Pc 和PoPc 处理。

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(责任编辑:陈海霞)

收稿日期:2021-09-14

基金项目:国家现代农业产业技术体系项目(CARS-36); 江苏省高校优势学科建设工程项目

作者简介:王阔鹏(1997-),男,河南许昌人,硕士研究生,从事反刍动物营养研究。(E-mail)1285385717@qq.com

通讯作者:林 淼, (E-mail ) linmiao@yzu.edu.cn