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主动饮酒对中脑腹侧被盖区GABA神经元形态学特征的影响

2022-07-15王琦玉张洪艳徐璐璐熊君伟关艳中

牡丹江医学院学报 2022年4期
关键词:线粒体神经元饮酒

王琦玉,张洪艳,王 雪,徐璐璐,熊君伟,关艳中

(牡丹江医学院生理学教研室,黑龙江 牡丹江 157011)

酒精使用障碍(Alcohol use disorder,AUD)是一种慢性疾病。患者表现出强迫性饮酒,不饮酒时表现出消极的情绪[1-2]。突触可塑性是中枢神经系统学习和记忆的基础[3-4]。它可以通过增加或降低突触强度来处理和存储信息。课题组发现,暴露于酒精会阻断大鼠VTA多巴胺神经元上GABAA受体介导的突触传递的长时程增强[5](Long-term potentiation of GABAergic synapses,LTPGABA)。但酒精对GABA神经元形态学产生的影响尚未阐明。Li[6]等人在之前的研究中发现,大鼠在戒断后72 h的酒精摄入量明显高于戒断0 h组。因此把戒断72 h作为一个时间点,在以下实验中分别进行探究。研究主动饮酒对VTA GABA的神经元形态学的影响,可以为AUD的临床预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重180~200 g,购自牡丹江医学院动物实验中心,实验动物生产许可证号:SYKX(黑)2019-006。所有动物被单独饲养在通风的有机玻璃笼中,在受控的灯照(12 h光照和12 h黑暗),温度20~25 ℃,接受过滤水和动物食品。所有程序均通过《国家实验室动物护理和使用卫生指南》和牡丹江医学院动物护理和使用委员会的指南批准。

1.1.2 实验试剂 5%水合氯醛,无水乙醇,4%多聚甲醛,蔗糖(≥99.5%,BioReagent),樱花冷冻包埋剂(OCT),丙酮,免疫染色通透液(triton x-100),PBS缓冲液(干粉),BSA,Anti-GAD67,抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗,DAPI,抗荧光淬灭封片液,2.5%戊二醛固定液,二甲胂酸钠缓冲液,1%四氧化锇,812环氧树脂,2%醋酸双氧铀,枸橼酸铅。

1.1.3 实验仪器 酶标仪(M3,国Molecular Devices 公司),激光共聚焦显微镜(Fv1000,奥林帕斯),透射电镜(2100 plus,日本日立)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型的建立 大鼠按体重随机分为对照组和饮酒组。饮酒组大鼠在第1天上午8点,接受两瓶液体,分别是100 mL 20%的酒精和100 mL水。在饮用水和酒精24 h之后,记录大鼠的液体摄入量,置换酒瓶放入一瓶水,此时饮酒组大鼠饮用两瓶水(戒断期),24 h之后置换出两个水瓶,放入100 mL 20%的酒精和100 mL水,酒瓶与水瓶的位置与第1天相反,以控制侧边偏好,以此模式循环4周,饮酒量达到3.2 g/(kg·24 h)为酒精成瘾大鼠。对照组大鼠自由饮用两瓶水。每周对大鼠的体重进行测量。

1.2.2 免疫荧光测定大鼠VTA GABA神经元 将30只雄性SD大鼠,按体重随机分为对照组(n=10),饮酒组(n=20)。按上述方法建立模型,将酒精成瘾大鼠分为戒断0 h组和戒断72 h组。使用水合氯醛(0.7 mL/100g)将大鼠麻醉,解剖后经心脏左心室灌注生理盐水(100~150 mL),取脑组织于4%的多聚甲醛中固定1 h,30%蔗糖脱水。分离VTA组织(bregma-4.30~bregma-6.30 mm),OCT胶包埋,冰冻切片5 μm,4 ℃丙酮固定,PBS洗涤(5 min×3),tritonX-100通透后PBS洗涤(5 min×3),5%BSA封闭1 h,吸去血清,加一抗(Anti-GAD67),4 ℃冰箱孵育过夜。PBS洗涤(5 min×3),荧光二抗[抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗]暗处30 min,PBS洗3次,DAPI染色10 min,PBS洗3次,封片使用激光共聚焦显微镜观察。每个样本选取3张切片观察,随机选取5个视野拍片、计数,取平均数。

1.2.3 Elisa测定大鼠VTA谷氨酸脱羧酶(GAD) 选取35只雄性SD大鼠,按体重随机分为对照组(n=10)和饮酒组(n=25)。建立模型后,将酒精成瘾大鼠分为戒断0 h组和戒断72 h组。脑组织匀浆离心取上清液。设置标准品孔,对照孔,样品孔。依次加入样品,酶标试剂。封板37 ℃温育1 h,洗涤5次后拍干。加入显色剂、37 ℃避光显色1 min,加入终止液,测吸光度。

1.2.4 大鼠VTA神经元超微结构的观察 选取20只雄性SD大鼠,随机分为对照组(n=6)和饮酒组(n=14)。建立模型后,将酒精成瘾大鼠分为戒断0 h组和戒断72 h组。取脑组织,大小为1 mm3,用2.5%戊二醛和二甲胂酸钠缓冲液固定;用1%四氧化锇(OsO4)后固定,脱水;环氧树脂浸润。超薄切片70 nm在网格上用2%醋酸双氧铀和枸橼酸铅进行染色,酒精脱水。每个实验组的标本在3个不同视野中观察。

1.3 统计学处理计量数据以“均数±标准差”表示,采用GraphPad Prism 7作图,不同组间使用Dunnet-t和t检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 酒精对大鼠VTA GABA神经元数量的影响与对照组(135.90±9.92)个/mm2相比,戒断0 h组GABA神经元计数(77.88±9.33)个/mm2和戒断72 h组GABA神经元计数(78.63±9.50)个/mm2均明显降低,具有统计差异(F2,23=110.7,P<0.01)。戒断0 h组和戒断72 h组相比,无统计差异(t=0.16,P>0.05),见图1。

图1 SD大鼠VTA GABA神经元激光共聚焦图像(×400,比例尺=50 μm)

2.2 酒精对大鼠VTA大鼠谷氨酸脱羧酶(GAD)的影响与对照组(46.92±3.27)ng/mL相比,戒断0 h组的GAD含量(32.21±4.79)ng/mL和戒断72 h组GAD含量(33.04±2.79)ng/mL均明显降低,具有统计差异(F2,27=49.45,P<0.01)。戒断0 h组和戒断72 h组相比,无统计差异(t=0.47,P>0.05)。

2.3 酒精对大鼠VTA神经元超微结构的影响对照组线粒体结构正常,神经纤维髓鞘结构完整;戒断0 h组与戒断72 h组神经元内线粒体肿胀变性、嵴断裂,神经纤维髓鞘结构松懈,密度降低,见图2。

图2 VTA神经元超微结构(28000)

注:A、B、C为神经元髓鞘;D、E、F为胞质内线粒体

3 讨论

γ-氨基丁酸(GABA)能神经突触活动与AUD的形成和发展关系密切,包括奖赏、戒断和复发等。突触可塑性,即神经元之间突触传递发生增强或减弱的改变。研究发现突触可塑性在AUD中发挥重要作用[7]。突触传递长时间增强的状态称为LTP。本实验室发现暴露于酒精会阻断大鼠VTA多巴胺神经元上GABAA受体介导的突触传递的长期增强(LTPGABA),本实验发现主动饮酒减少VTA GABA神经元的数量。Smile等也发现,酒精会降低GABA神经元数量[8]。他们检测了出生后第7天酒精处理后成年小鼠皮层体积、厚度和细胞组织的变化,发现脑体积在酒精处理下减少10~13%,大脑皮层表现出相似的减少,神经元总数下降幅度约为8%,GABA神经元数量显著减少30%。在C57BL/6和BALB/cJ小鼠品系中也发现了类似的酒精效应。

GABA是控制突触兴奋、抑制所需的抑制性神经递质,它由GAD合成[9-11]。GAD为GABA神经元的特异性标记酶,它的表达和活性与GABA水平以及抑制突触的GABA能神经传递高度相关。我们的研究结果显示酒精会降低VTA GAD表达,提示主动饮酒可能抑制VTA GABA合成。但Lee S E[12]等人发现,急性和短期酒精使大鼠脑各区域GAD活性升高。这种差异可能是不同脑区对酒精的反应不同造成的。

本实验进一步观察了VTA神经元的超微结构。结果显示,对照组线粒体结构正常,神经纤维髓鞘结构完整;戒断0 h组与戒断72 h组神经元内线粒体肿胀变性、嵴断裂,神经纤维髓鞘结构松懈,密度降低。Cui Z J[13]等人发现,在饮酒的动物中,突触的超微结构发生了显著变化。突触间隙的宽度明显减少,并伴有突触后膜增厚,突触囊泡数量减少。Skuja S等人[14]对酒精使用者前额叶皮质、纹状体和黑质进行研究,发现神经元轴突末梢不肿大或轻微肿大,并含有大量突触囊泡,突触前和突触后膜增厚,轴突末梢包含有规则形状的线粒体,嵴变窄且略弯曲等,轴突呈不规则形状,包括肾形,线粒体呈不同程度的管状嵴扩张。树突表现为明显肿胀,微管很少,体积增大,线粒体肿胀,嵴缩小。这与我们的研究结果相一致,表明酒精可以损害神经元超微结构。

综上所述,主动饮酒会降低GABA神经元数量,损害GABA神经元的超微结构,对酒精成瘾中枢机制探索和临床防治提供了科学资料。

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