张 彪

(北京环域生态环保技术有限公司，北京 100012)

1 引言

城市生活污水经过污水处理厂处理后作为景观用水广泛应用于我国较为缺水的北方地区[1]。但是污水处理厂出水中氮、磷含量较高，作为景观水体容易发生水体富营养化[2]。仿生水草作为一种治理水污染的有效手段已经被广泛使用，其原理是仿生水草表面形成微生物膜，依靠微生物的代谢分解水体中的有机物，吸收氮、磷等营养元素及矿物质，可以有效起到净化水体的作用[3]。细菌是水生生态系统中重要的组成部分，也是微生物膜降解污染物的主要参与者，不同的细菌群落对于污染物降解具有一定的差异性，因此通过研究水环境治理过程中仿生水草微生物膜细菌群落多样性变化和水体富营养化状态的变化，揭示仿生水草微生物膜细菌群落变化对水体富营养化状态的影响，了解富营养化水体中微生物群落结构变化具有重要意义[4，5]。环境微生物群落结构组成复杂，目前只有1%的细菌在实验室环境中分离培养[6]，对于了解富营养化水体群落结构组成以及微生物膜多样性造成了极大的障碍，利用高通量技术对富营养化水体中仿生水草微生物膜进行16SrDNA测序，得到了大量的基因序列，克服了传统培养技术的局限性，可以全面准确地反映细菌群落结构组成对水体富营养化状态变化的影响。

2 材料与方法

2.1 实验材料

本实验所用人工生态基是碳纤维仿生人工水草，长200 cm，直径5 cm，这种仿生人工水草具有比表面积大、亲水性强、吸附能力强、强度高、质轻、耐腐蚀，使用寿命长的特点，可以在短时间内形成微生物膜，并且安全性好，不易造成二次污染。

2.2 实验用水

本实验的实验装置位于某景观河道内，该景观水体以污水处理厂尾水作为水源，由于水源中氮、磷含量较高，体缺乏管理，同时具有外源污染进入，最终导致水体富营养化严重，蓝藻爆发，甚至水体一度出现黑臭现象，严重影响周边居民的生活，丧失景观水体的作用。该景观水体水质如表1所示。

表1 实验水体水质

2.3 实验过程

本实验主要采取了以下措施：实验河段切断了外源污染的进入，同时为了提高水体溶解氧，采取了人工曝气增氧的措施，将人工水草以16根/m2的密度均匀布置于实验河段水体中，人工水草长度与河道水深一致。

水样采集及处理：仿生人工水草安装完成后，每周采样一次，进行水质检测，水质监测项目包括：透明度、叶绿素、氨氮、总磷、总氮、CODMn，其中透明度现场测定，其余项目进行实验室检测。

生物膜样品采集及处理：实验过程中每个月采集一次人工生态基生物膜样品，取水下20 cm处人工生态基微生物膜，置于灭菌培养皿，用干冰低温保存送至上海生物工程有限公司进行高通量测序。

2.4 实验项目分析方法

实验主要测试指标及方法见表2。

表2 实验测试指标及测试方法

2.5 水体富营养化综合评价方法

水体富营养化评价方法有许多种，本文采用综合营养状态指数法[7]。

综合营养状态指数法计算公式为：

TLI(∑)=∑Wj·TLI(j)

(1)

式(1)中：TLI(∑)为综合营养状态指数；Wj为第j中参数的营养状态指数的相关权重；TLI(j)为第j中参数的营养状态指数。 以Chla作为基准参数则第j种参数的归一化的相关权重计算公式为：

(2)

式(2)中：rij为第j种参数与基准参数Chla的相关系数；m为评价参数的个数。

表3 中国湖泊(水库)部分参数与叶绿素a的相

湖泊富营养化状况评价指标包括Chla、TN、TP、SD和CODMn五项，各项营养状态指数计算如公式(3)～(7)所示：

TLI(Chla)=10×(2.5+1.086×LnChla)

(3)

TLI(TP)=10×(9.436+1.624×LnTP)

(4)

TLI(TN)=10×(5.453+1.694×LnTN)

(5)

TLI(SD)=10×(5.118-1.94×LnSD)

(6)

TLI(CODMn)=10×(0.109+2.661×LnCODMn)

(7)

式(3)～(7)中：Chla单位为mg/m3；SD单位为m；其他指标单位均为mg/L。

富营养化分级标准采用0～100一系列连续数字对湖泊(水库)营养状态进行分级：

综合营养状态指数TLI(∑)<30为贫营养，30≤TLI(∑)≤50为中营养，TLI(∑)>50为富营养，5070重度富营养，在同一营养状态下，指数值越高，其营养程度越重。

3 实验结果与讨论

3.1 Alpha多样性分析

由表4可知，通过对仿生人工水草微生物膜样品进行高通量测序，得到总优化序列在31862-23268条，在97%相似性水平下，所有序列被划分为3121-7136个OTUs，OTUs变化范围很大，表明仿生水草微生物膜细菌群落基因序列多样性和丰度具有较大变化。ACE指数、Chao指数和香农指数越高表明细菌群落微生物多样性越高，辛普森指数越低表明细菌群落微生物多样性越高，表4中5～7月份的ACE指数、Chao指数和香农指数呈上升趋势，辛普森指数呈降低趋势，其中，因此综合分析结果显示随着试验时间的延长，仿生人工水草微生物膜细菌群落多样性及丰度显著增加。

表4 97%水平下多样性指数和丰度

3.2 仿生水草微生物膜细菌群落组成分析

不同时间段微生物膜细菌群落通过高通量测序共检测出的微生物共涉及26个门，54个纲，以及一些未被分类的微生物OTU。图1是5～9月份微生物膜细菌群落在门水平下的微生物膜细菌群落结构图。

图1 5～9月份微生物膜细菌在门水平分类和比例

由图1可知，5～9月份微生物膜细菌群落结构组成差异较大，随着实验时间的延长，在门水平上微生物膜细菌群落丰度逐渐增大。虽然在不同时间段微生物膜细菌群落多样性差异较大，但是在不同时间段仿生水草微生物膜中的变形菌门-Proteobacteria(48.68%～62.21%)、拟杆菌门-Bacteroidetes(2.67%～16.04%)、厚壁菌门-Firmicutes(2.01%～13.8%)、浮霉菌门-Planctomycetes(0.71%～9.29)、疣微菌门-Verrucomicrobia(0.14%～26.12%)、蓝藻菌门-Cyanobacteria(2.22%～16.24%)、绿弯菌门-Chloroflexi(0.17%～3.24%)，硝化螺旋菌门-Nitrospirae(0～1.56%)、酸杆菌门-Acidobacteria(0.02%～1.56%)等9个细菌门占优势。其中，5～9月份仿生水草微生物膜细菌群落中变形菌门的相对丰度占有绝对优势，所占比例分别为49.03%、62.21%、48.72%、53.43%和48.68%。王绍祥等[9]对水库春季样品进行16S测序在门水平上的结果表明：优势物种分别是变形菌门、蓝藻菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、放线菌门、绿湾菌门、厚壁菌门、疣微菌门和酸杆菌门，与笔者实验过程中对微生物膜样品进行高通量测序在门水平上所得结果相似，属于典型的水生微生态系统类群。

3.3 微生物膜降解污染物机理—以硝化细菌去除氨氮为例

微生物膜细菌群落优势物种如图2所示，其优势物种相对于传统活性污泥更丰富，包括变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、浮霉菌门、疣微菌门、蓝藻菌门等。有研究表明在不同污水、废水活性污泥处理系统中细菌群落分布主要以变形菌、绿弯菌、放线菌、厚壁菌和拟杆菌为功能菌群[10]，降解水体中的污染物。有研究显示变形菌门可以有效去除水体中的有机物[11]。厚壁菌门属于革兰氏阳性菌，可以在有氧或缺氧的环境中进行新陈代谢，并主要参与硝化和反硝化过程[12]。浮霉菌门微生物广泛存在于厌氧环境中，如淡水水体、海洋沉积物、污水处理系统以及土壤中[13]。其中大部分浮霉菌门种类对水体中的氨氮及亚硝酸盐氮均有较好的去除作用[14]。拟杆菌有利于促进含氮物质的利用、类固醇生物转化及水解大分子物质等[15]。从这些研究成果中可以发现不同种类的微生物对于水体中的污染物的去除具有一定的选择性和差异性。生物膜法和活性污泥法对污染物去除的主要作用原理及菌群基本一致，因此从微观上分析，仿生水草微生物膜细菌群落多样性的升高，对于去除水体中的污染物种类及效果具有正向作用，仿水草微生物膜多样性增加也可以更有效地降解水体中的污染物，抑制水体富营养化。

图2 门水平下微生物膜细菌群落丰度柱状

硝化螺旋菌是生物脱氮的重要参与者，能够通过硝化作用将氨氮转化为硝酸盐氮，从而去除水体中的氨氮，是典型的脱氮生物。由图3可知，随着实验时间的延长，在门水平上硝化螺旋菌含量具有显著提升，5月份的最低相对丰度为0，7月份最高相对丰度达到1.56%。之所以发生这种现象，推测可能是由于前期黑臭水体溶解氧处于缺氧或厌氧状态，硝化细菌等好氧菌受到抑制，在人工水草微生物膜中含量很低未能检测到。采取人工充氧措施后，黑臭水体溶解氧含量逐渐升高，厌氧、缺氧状态得到改善，硝化细菌等好氧微生物活跃，相对丰度显著提升，这对实验水体脱氮具有正向作用。从图3可以看出，随着微生物膜硝化螺旋菌丰度的提高，水体中的氨氮含量呈显著下降趋势。通过SPSS对氨氮浓度和硝化螺旋菌丰度在95%置信区间进行相关性分析，微生物膜硝化螺旋菌丰度和氨氮浓度相关系数为-0.713，呈负相关。在门水平上随着硝化螺旋菌相对丰度的提高，可以有效降解水体中的氨氮，消除水体黑臭，降低水体富营养化程度。

图3 硝化螺旋菌丰度变化曲线和氨氮变化柱状

实验时间为5～9月份，实验过程中得到的实验数据是在水体温度相对适合微生物生长代谢的情况下得到的，但是缺少微生物膜在低温状态下的相关数据，因此实验得出的结论对于微生物膜在适宜温度下适用，在低温状态下微生物膜丰度及水处理效果仍需验证。

3.4 水体富营养化变化

综合营养状态指数-TLI(∑)[16]能够综合评价水体富营养化，对水体富营养化程度可以进行一个清晰直观的判断。从表5中可以看出：在5个月内，氨氮、高锰酸盐指数、TP、TN等污染物含量显著下降，综合营养状态指数逐渐下降，综合富营养化指数从5月份的TLI(∑)=85.7(重度富营养)，到9月份的TLI(∑)=57.7(轻度富营养)，水体富营养化指数显著下降，从重度富营养化状态逐渐下降至轻度富营养化状态。实验结果表明：仿生水草微生物膜技术可以有效去除水体中的污染物，对改善水体富营养化具有显著效果。

表5 水体富营养化变化

3.5 微生物膜细菌物种多样性与水体富营养化相关性

微生物膜细菌群落结构组成、微生物数量受到外界环境因子的影响，表现出多样性，而微生物细菌群落结构、多样性以及微生物量也可以对外界环境产生影响，因此微生物细菌群落多样性与外界环境因子之间存在一定的相关性。图4是香农指数和富营养化变化图，从图4中可以看出：通过仿生水草微生物膜处理可以显著改善水体富营养化，从5～9月份，实验水体从重度富营养状态，逐渐改善为轻度富营养状态，水体水质得到显著改善，同时随着水体水质等外界环境因子变化，香农指数也发生了一定的变化，表明仿生水草微生物膜细菌多样性受到外界环境的影响也发生了一定的变化，本实验中仿生人工水草微生物膜在门水平上主要以变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、浮霉菌门、疣微菌门、蓝藻菌门、绿弯菌门，硝化螺旋菌门、酸杆菌门为优势种，通过上文可知在微生物膜上优势种在门水平上多样性随着时间的延长具有显著变化，因此可知仿生水草微生物膜细菌群落多样性与水体富营养化程度存在一定的相关性。

图4 香农指数和富营养化指数变化

微生物膜细菌群落多样性与环境因子及富营养化指数相关性如表6所示。从表6中可以看出，香农指数与TN、TP、高锰酸盐指数、叶绿素a浓度、透明度具等外界环境因子呈负相关关系，说明采用仿生水草生物膜法治理黑臭水体污染过程中，仿生水草微生物膜细菌群落多样性与氮、磷和有机物等污染物呈负相关关系，仿生水草微生物膜细菌群落多样性高有利于水体中污染物的去除，其中香农指数与TN、TP和高锰酸盐指数相关性较高，相关性指数分别为-0.840、-0.789和-0.814，说明微生物膜细菌群落多样性对氮、磷和有机物等环境因子影响相对更大；香农指数与富营养化指数呈负相关，相关性指数为-0.784，表明微生物膜细菌多群落样性与水体富营养化状态呈负相关关系，仿生水草微生物膜细菌群落多样性能够在一定程度上影响水体富营养化程度，仿生水草微生物膜细菌群落多样性高能够提高污水处理效率，可以在一定程度上抑制水体富营养化。

表6 细菌群落多样性与不同环境因子相关性

4 结论

Alpha多样性分析中ACE指数、Chao指数、香浓指数、辛普森指数均表明随着实验的进行，5～9月份仿生水草微生物膜细菌群落多样性呈上升趋势。仿生水草微生物膜，属于典型的水生微生态系统类群，在不同时间段以变形菌门-Proteobacteria(48.68%～62.21%)、拟杆菌门-Bacteroidetes(2.67%～16.04%)、厚壁菌门-Firmicutes(2.01%～13.8%)、浮霉菌门-Planctomycetes(0.71%～9.29)、疣微菌门-Verrucomicrobia(0.14%～26.12%)、蓝藻菌门-Cyanobacteria(2.22%～16.24%)、绿弯菌门-Chloroflexi(0.17%～3.24%)，硝化螺旋菌门-Nitrospirae(0～1.56%)、酸杆菌门-Acidobacteria(0.02%～1.56%)等9个细菌门为优势种，其中变形菌门在不同时间段均为绝对优势种。根据微生物对污染物去除机理的不同，微生物对于水体中的污染物具有一定的选择性和差异性，仿生水草微生物膜细菌群落多样性升高，对于去除水体中的污染物种类及效果具有正向作用，使仿水草微生物膜更有效降解水体中的污染物。通过对仿生水草微生物膜细菌群多样性、富营养化指数以及不同环境因子进行相关性分析，结果表明：TN、TP和有机物对仿生水草微生物膜多样性影响相对更大，呈负相关；微生物膜多群落样性与水体富营养化状态呈负相关关系，仿生水草微生物膜群落多样性升高能够在一定程度上抑制水体富营养化程度，实验水体随着仿生水草微生物膜细菌群落多样性的升高，由富营养化水体逐步改善至轻度富营养化水体，水体富营养化程度得到显著改善。