袁先铃，周莺茹，郑连强

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000)

四川酸菜主要是以芥菜作为加工原料，通过乳酸菌和酵母菌等微生物发酵而成的一种发酵类食品，在四川简称盐渍青菜[1-2]。据史册记载，酸菜的制作工艺已有440多年的历史[3]。在发酵技术的研究中，欧洲的科研工作者首先开发出乳酸菌纯种发酵技术，比如加拿大的考德威尔生物发酵公司率先获得了酸菜发酵菌株专利技术[4]；国内对酸菜的研究主要是应用微生物纯培养技术，比如乳杆菌的分离筛选等。传统自然发酵依赖于单一的乳酸菌发酵[5]，从纯种乳酸菌发酵技术再到直投式乳酸菌发酵技术的发展，更加明确了酸菜发酵过程中微生物的作用；技术的发展缩短了酸菜发酵的时间；改善了酸菜的风味、质地；提高了酸菜的食用安全[6-8]。吴钰清等[9]以崇左江州镇保安酸菜为试验原料，发现用0.04%氯化钙处理酸菜30 min，在4 ℃下真空保藏，酸菜的脆度最佳。赵金海等[10]研究得出酸菜在发酵剂添加量为3%，菌种比例(肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌)为1∶2，发酵温度为20 ℃，发酵时间为16 d的酸菜有光泽，无异味，酸味纯正柔和，略带甜味，清脆可口。张玉龙等[11]采用明串珠菌和乳酸杆菌复配出酸菜发酵剂，接入到自然发酵酸菜中进行发酵，取得了良好的酸菜成品。

本试验以从自然发酵酸菜中筛选出的植物乳杆菌和类干酪乳杆菌为研究目标，通过单因素试验和正交试验对酸菜进行工艺优化，其成果对促进和加快酸菜这一传统食品的现代化生产，缩短酸菜的生产周期，降低生产成本，改善酸菜的风味和提高酸菜的质量、工业经济效益等均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芥菜：购于成都农家市场。

目标菌：A6植物乳杆菌、A8类干酪乳杆菌菌株(从自然发酵酸菜中分离所得菌株)。

1.2 仪器与设备

SHP-250E生化培养箱 上海培因试验仪器有限公司；SW-CJ超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；Legend Micro 17离心机 ThermoFisher Scientific公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；泡菜坛子 景德镇市承启陶瓷有限公司；电磁炉 深圳绿智电磁炉有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵酸菜的制作

发酵酸菜制作工艺：白菜整理→清洗→切分→称量→热烫→冷却→入缸→注入盐水→人工接种→密封→发酵→成品。

1.3.2 菌株接种量的选择

以食盐浓度为2%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为20 d，菌种比例植物乳杆菌∶类干酪乳杆菌为1∶1，设置接种量为5%、6%、7%、8%、9%、10%进行乳酸菌酸菜发酵试验。

1.3.3 发酵时间的选择

以食盐浓度为2%，接种量为8%，发酵温度为30 ℃，菌种比例植物乳杆菌∶类干酪乳杆菌为1∶1，发酵时间分别为5，10，15，20，25，30 d进行乳酸菌酸菜发酵试验。

1.3.4 盐水浓度的选择

以发酵温度为30 ℃，发酵时间为20 d，接种量为8%，菌种比例植物乳杆菌∶类干酪乳杆菌为1∶1，设置盐水浓度为2%、3%、4%、5%、6%、7%进行乳酸菌酸菜发酵试验。

1.3.5 发酵温度的选择

以食盐浓度为2%，接种量为8%，发酵时间为20 d，菌种比例植物乳杆菌∶类干酪乳杆菌为1∶1，设置发酵温度为15，20，25，30，35 ℃进行乳酸菌酸菜发酵试验。

1.3.6 发酵酸菜条件优化

最佳发酵条件因素水平表见表1。

表1 最佳发酵条件因素水平表Table 1 The factors and levels of optimal fermentation conditions

以试验所分离筛选的菌株作为添加菌株，将菌株进行扩增培养，采用蔬菜培养基：分别取新鲜番茄、青瓜和包菜，清洗后在粉粹机中粉粹，用6层滤布过滤，滤液即为相应的蔬菜培养基，灭菌后备用。包菜汁与青瓜汁配比为2∶1时适宜植物乳杆菌生长；类干酪乳杆菌采用包菜汁∶胡萝卜汁∶番茄汁为1∶1∶1时适宜生长[12]。

综合参考文献[13-14]，依据试验1.3.2选择最佳接种量，依据试验1.3.3选择最佳发酵时间，依据试验1.3.4选择最佳盐水浓度，依据试验1.3.5选择最佳发酵温度。采用L9(34)正交试验，按酸菜发酵工艺流程接种发酵。酸菜发酵所用的容器为泡菜坛子，体积为1.2 L，装菜量大约为0.25 kg，加水约0.5 L，坛口水封。菌种比例为1∶1，同时设置不接种作为对照[15]。按照正交试验表(见表2)逐一进行试验，发酵完成后测定pH和乳酸菌菌落数。每个样品平行测定3次。

表2 最佳发酵条件正交试验表Table 2 The orthogonal test of optimal fermentation conditions

1.3.7 优化后酸菜成品感官评价

酸菜感官评价：邀请10名食品专业的研究生担任评审员，各取发酵30 d的样品25 g，按照感官评定表(见表3)给酸菜成品打分，满分100分[16]。

表3 酸菜感官评价标准表Table 3 The sensory evaluation criteria of pickles

2 结果与分析

2.1 酸菜发酵菌液pH值变化

在20，25，30 ℃的发酵温度下，不同菌株引起酸菜发酵液pH值在20 d的变化见图1。

a.20 ℃时pH值的变化

b.25 ℃时pH值的变化

c.30 ℃时pH值的变化

由图1可知，20，25，30 ℃发酵时，接入乳酸菌的酸菜均比未接入乳酸菌的酸菜pH值下降快，植物乳杆菌和类干酪乳杆菌发酵酸菜的发酵液pH值变化均较小，比未接入菌株的pH值低，平衡后最终pH值为3.13和3.14。

自然发酵泡菜的发酵过程分为3个发酵阶段：初期发酵阶段、中期发酵阶段和后期发酵阶段。自然发酵酸菜在0～5 d时pH值下降较慢，在发酵5～10 d时pH值下降迅速，而在10～20 d时pH值下降非常缓慢，其变化可能是在发酵初期有少量乳酸菌，优势菌为好氧菌和酵母菌，这两种菌对乳酸菌的繁殖有抑制作用，从而使pH值变化小；发酵中期，乳酸菌变为优势菌，pH值下降较快；而当进入末期，乳酸菌繁殖进入稳定期，使pH值下降较慢。人工接种乳酸菌使发酵酸菜没有初期，直接进入发酵中期，接入乳酸菌发酵减少了发酵初期，使发酵时间缩短，同时产酸抑制其他菌的生长。

2.2 接种量的选择

不同接种量酸菜发酵液pH值随发酵时间的变化曲线见图2。

图2 不同接种量酸菜发酵液pH值的变化Fig.2 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles with different inoculation amount

由图2可知，在5～20 d时不同接种量酸菜发酵液均呈下降趋势，但在5～10 d时，接种量为8%的发酵液pH值变化较其他接种量更显著，而在20 d后均趋于平缓。感官分析酸菜颜色透明，菜帮颜色良好，风味纯正。

2.3 发酵时间的选择

图3 不同发酵时间酸菜发酵液pH值的变化Fig.3 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles at different fermentation time

由图3可知，随着发酵时间的延长，酸菜的pH值逐渐降低，在5～15 d时变化最明显，呈下降趋势，在发酵20 d时，pH值达到最低，为3.11，感官分析酸菜颜色透明，菜帮颜色均一，风味纯正。20 d后基本持平，当发酵25 d时，pH值为3.12，菜帮颜色变暗；发酵30 d时pH值为3.13，感官分析发酵30 d时酸菜口感过酸，质地变软，颜色发暗，表明发酵过度。

2.4 盐水浓度的选择

不同盐水浓度酸菜发酵液的pH值随发酵时间的变化曲线见图4。

图4 不同盐水浓度酸菜发酵液pH值的变化Fig.4 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles with different brine concentrations

由图4可知，盐水浓度为4%时，发酵液的pH值下降最显著，且在20 d时pH值最低，达到了3.13，而盐水浓度为7%时，pH值在10～25 d时变化缓慢，在发酵30 d时，pH值略微增加，感官分析酸菜颜色变黑，菜叶有腐烂，菜帮没有脆性。

2.5 发酵温度的选择

图5 不同发酵温度酸菜发酵液pH值的变化Fig.5 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles at different fermentation temperatures

由图5可知，pH值随着发酵温度的变化呈先下降后上升的趋势，酸菜发酵液在30 ℃发酵过程中pH值下降速度更快，原因在于乳酸菌的最适宜生长温度为30 ℃。因此，在30 ℃时乳酸菌生长繁殖快，产酸量大。

2.6 正交试验优化

正交试验结果用SPSS软件进行数据分析，极差分析结果见表4和表5，方差分析结果见表6。

2.6.1 不同因素水平下的pH值

不同因素水平下的pH值见表4。

表4 不同因素水平下的pH值Table 4 The pH values at different factors and levels

由表4可知，影响pH值的各因素主次顺序为D>A>C>B，即温度对酸菜pH值的影响最大，而发酵时间的影响最小。最优水平为A2B2C3D2，即以pH值为评价指标，酸菜发酵的最佳发酵条件为：接种量为8%，发酵时间为20 d，盐水浓度为5%，发酵温度为30 ℃。由于最优水平不在试验组中，选取最佳发酵条件进行重复试验，所得的pH值的平均值为3.04。证明正交试验条件：接种量8%、发酵时间20 d、盐水浓度5%、发酵温度30 ℃为最优水平。

2.6.2 不同因素水平下酸菜乳酸菌菌数试验结果

不同因素水平下乳酸菌菌数试验结果见表5。

表5 不同因素水平下酸菜乳酸菌菌数正交试验结果Table 5 The orthogonal test results of lactic acid bacteria count of pickles under different factors and levels

由表5可知，影响酸菜乳酸菌菌数的各因素主次顺序为D>A>B>C，即发酵温度对酸菜发酵后乳酸菌菌数的影响最大，而盐水浓度的影响最小。最优水平为A2B2C1D2，即以乳酸菌菌数作为评价指标，酸菜发酵的最佳发酵条件为：接种量为8%，发酵时间为20 d，盐水浓度为3%，发酵温度为30 ℃。由于最优水平不在试验组中，选取最佳发酵条件进行重复试验，所得的乳酸菌菌数的平均值为8.3×102CFU/mL。证明正交试验条件：接种量8%、发酵时间20 d、盐水浓度3%、发酵温度30 ℃为最优水平。

表6 正交试验方差分析结果Table 6 The results of variance analysis of orthogonal experiment

续 表

由表6可知接种量、发酵时间、盐水浓度、温度对pH值、乳酸菌菌数测定的影响，发现温度对pH值和乳酸菌菌数具有显著影响。

2.6.3 最佳发酵工艺条件的确定

从pH值和乳酸菌菌数这两个指标综合考虑，所确定的最佳接种量、最佳发酵时间以及最佳发酵温度均一致，分别为8%、20 d及30 ℃，而在盐水浓度上有差异，若以pH值为筛选指标，盐水浓度为5%；若以乳酸菌菌数为筛选指标，则盐水浓度为3%。发酵试验表明，盐水浓度为3%的酸菜产品比盐水浓度为5%的口感要好。

因此，综合考虑pH值、乳酸菌菌数和实际酸菜发酵成品的口感，最终确定选择最佳发酵条件A2B2C1D2：接种量为8%，发酵时间20 d，盐水浓度3%，发酵温度30 ℃。所对应的发酵酸菜的最佳工艺条件：接种量为8%，菜水比为1∶2，菌种比例植物乳杆菌∶类干酪乳杆菌为1∶1，菌种培养基为蔬菜培养基，食盐浓度为3%，30 ℃发酵20 d。

2.7 酸菜成品的感官评价

自然发酵酸菜与接种发酵酸菜评分见表7，对比可以看出，正交试验接种发酵酸菜的感官评分为88.7，自然发酵酸菜的感官评分为73.1；正交试验接种发酵酸菜的感官评分高于自然发酵酸菜。自然发酵酸菜有少量发生腐烂，且有难闻的气味；而优化后发酵酸菜样品色泽都良好，均优于自然发酵酸菜，这与王旭丹[17]研究直投式酸菜发酵剂发酵酸菜优于自然发酵酸菜的感官品质一致，外观浅黄色，发酵液澄清微黄。自然发酵酸菜发生腐烂的原因是芥菜中含有少量的乳酸菌，生长繁殖较慢，发酵过程中难免会有腐败菌产生并且快速繁殖，从而抑制乳酸菌的繁殖。

表7 酸菜样品感官评价得分Table 7 The sensory evaluation scores of pickle samples

3 结论

从自然发酵酸菜中得到A6植物乳杆菌和A8类干酪乳杆菌两株乳酸菌，通过单因素试验和正交试验，综合考虑pH值、乳酸菌菌数和实际酸菜发酵成品的口感，得到最佳发酵工艺条件：接种量为8%，发酵时间为20 d，食盐浓度为3%，发酵温度为30 ℃，菜水比为1∶2，菌种比例植物乳杆菌∶类干酪乳杆菌为1∶1。在此优化条件下，将优化后的酸菜与自然发酵酸菜进行感官评定，结果发现优化后的酸菜在色泽、香气、滋味和脆度4个方面均要高于自然发酵酸菜。本研究为大规模工业化生产优质酸菜提供了有益参考。