赵珈华，李玉婷，刘 洋，桂金秋，李亚彤，石学魁，唐小云

(牡丹江医学院 1.病原生物学教研室；2.病原生物学实验室，黑龙江 牡丹江 157011)

黄芪是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的成熟干燥根茎，是东北地区道地药材，其性味甘、微温，归脾、肺经，具有补气健脾的功效，被称为“补药之长”[1-2]。黄芪含有丰富的皂苷类、黄酮类，以及多糖类成分[3]。目前对于黄芪活性成分研究居多，但对于黄芪多糖对超敏反应影响机制的研究尚少。研究表明，多糖具有抗氧化、免疫调节、降血糖、降血脂等生物活性，且无毒、无抗药性作用[4-6]。因此本文探讨黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)对迟发型超敏反应(Delayed-type hypersensitivity，DTH)小鼠的影响，观察黄芪多糖对DTH模型小鼠肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器Bio-Rad S100PCR自动系列化分析仪(Bio-Rad)，ABI 7500实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher)，Sigma 3K15台式高速冷冻离心机(Sigma)，XS-104精密电子分析天平(METTLER TOLEDO)。

（2）进行电气设备配管下料时，必须要由专业的监理工程师进行施工监督，且施工的整个过程，都需要按照施工规范与设计规范进行相应施工，施工时若发现下料的材料不符合质量要求，必须进行更换，以确保电气设备的质量与安全性。

1.2 主要药品与试剂APS购于西安瑞林生物科技有限公司，批号：HQC210416，纯度>90%；DNFB购于西亚化学科技(山东)有限公司，批号A48120，分析纯；醋酸地塞米松片，安徽金太阳生化药业有限公司(批号：国药准字H34021845)；总RNA提取试剂盒购于索莱宝科技有限公司；cDNA第一链合成试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；Oxoid酵母粉购于上海根生生物科技有限公司；无菌均质袋、2.5 L厌氧产气包、伊红美兰培养基琼脂、粪肠球菌培养基琼脂、乳酸杆菌培养基琼脂、双歧杆菌培养基琼脂均购于青岛海博生物技术有限公司。

1.3 实验动物SPF级ICR小鼠，50只，6～8周龄，雄性，体质量(20±2)g，由牡丹江医学院比较医学中心提供，在温度为(24±2)℃ 无菌的SPF动物房饲养，昼夜光照12 h, 自由饮水和标准的小鼠饲料。本研究已取得牡丹江医学院动物福利与伦理委员会批准。

诊断与纳排标准 纳入标准：（1）使用含替诺福韦的方案治疗后出现肾损伤；（2）符合药物不良反应关联性评价。排除标准：（1）糖尿病肾病、人类免疫缺陷病毒 （HIV）相关性肾病和高血压肾病人群；（2）其他药物导致的肾损伤。

本部分首先使用现实数据对本文构建的包含耐用品部门与非耐用品部门的基准模型进行校准与贝叶斯估计，在此基础上，分析模型的动态特征并考察耐用品部门对货币政策动态效应产生的影响。

1.4.3 脾指数的计算 致敏24 h后称重小鼠，颈椎脱臼处死，取脾称重。脾指数(mg/g)=脾质量(mg)/体质量(g)。

1.4.1 实验动物造模及分组 将50只SPF级ICR小鼠随机分为NC组、MC组、DEX组、APS-L组以及APS-H组，每组10只。在常规饮食饮水的基础上，各组小鼠背部脱毛2 cm2，其中MC组、DEX组、APS-L组以及APS-H组小鼠给予0.7%DNFB(溶于丙酮：橄榄油1∶1)85 μL背部激发造模，连续2 d，而NC组背部脱毛后给予等量丙酮橄榄油涂抹。激发当日DEX组、APS-L组、APS-H组分别以地塞米松2.5 mg/(kg·d)、APS 200 mg/(kg·d)、APS 400 mg/(kg·d)灌胃0.2 mL，NC组和MC组以等量无菌三蒸水灌胃，1次/d，连续7 d。末次给药30 min后，DEX组、APS-L组、APS-H组和MC组用微量移液器吸取0.7%DNFB 20 μL，均匀滴加于小鼠右耳前后两面致敏，同时左耳涂抹等量丙酮橄榄油溶液作为对照，NC组仅右耳前后涂抹等量丙酮橄榄油，左耳不做处理。致敏24 h后处死小鼠采集标本进行相关指标检测。

2.2 黄芪多糖对DTH模型小鼠脾指数的影响MC组与NC组比较，脾指数明显升高，差异有统计学意义(P<0.0001)；APS-L组和APS-H组与MC组比较，脾指数均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；DEX组与MC组比较差异无统计学意义，说明APS对DTH引起的炎症反应有明显的抑制作用，APS-L组与APS-H组之间无明显统计学差异，见表4。

1.4 实验方法

“哎哟，不错嘛，你们说的这两句诗分别出自于白居易的诗歌《问刘十九》和《别毡帐火炉》。除此之外，在《即事重题》等诗歌里他也提到过炉子。”

水权所有者拥有的水权，是其合法拥有的资产，只要不违反水权使用、交易的相关法规，其水权就受法律保护而不能受他人侵害，也不能被政府剥夺。

2.1 黄芪多糖对DTH模型小鼠耳肿胀度的影响MC组小鼠耳肿胀度与NC组比较差异具有统计学意义(P<0.0001)；与MC组比较，APS-L组和APS-H组小鼠耳肿胀度明显降低，差异具有统计学意义(P<0.0001)，说明APS对DNFB所致DTH有明显的缓解作用。APS-L组与APS-H组之间无明显统计学差异，见表4。

表1 肠道细菌培养基和稀释度的选择及相关培养条件

2.4 黄芪多糖对DTH模型小鼠肠道菌群的影响伊红美兰培养基琼脂、粪肠球菌培养基琼脂、乳酸杆菌培养基琼脂、双歧杆菌培养基琼脂，分别用于大肠杆菌、粪肠球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的培养。结果发现与NC组相比较，MC组小鼠肠道大肠杆菌和粪肠球菌数量明显增加，双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显减少，差异具有显著性差异(P<0.001)。与MC组相比较，APS-L组和APS-H组的乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均明显增加，具有显著性差异(P<0.0001)，APS-L组和APS-H组大肠杆菌均明显减少，具有显著性差异(P<0.0001)。详情见表5。

1.5 统计学分析采用Graphpad Prism 8.0统计软件进行数据分析,实验数据以“均数±标准差”表示，多组间的比较采用单因素方差分析，并进行多重比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

表3 实时荧光定量PCR反应体系

2 结果

从图8a可以看出,在眼壁区域内,没有反气旋性辐散和正变高相匹配,也没有气旋性辐合和负变高项匹配,说明眼壁区域没有表现出涡旋Rossby波的特征。在眼壁区域外,也没有辐合(散)区和反气旋(气旋)区重叠,即眼壁外侧也没有表现出重力波的特征。说明内雨带的发展和混合波也是没有关系的。

1.4.4 HE染色 取各组小鼠相同位置耳组织，用4%中性甲醛固定，石蜡包埋，6 μm切片，HE染色，光镜观察耳片病理学变化情况，获取切片图像。

表4 黄芪多糖对DTH小鼠的治疗作用

1.4.2 耳肿胀度的计算 颈椎脱臼处死小鼠，分别剪下双耳，对齐双耳用8 mm打孔器在相同部位打下圆耳片，称质量，左、右耳片质量差为其肿胀度。

图1 各组小鼠耳组织病理学变化(×100)

2.3 黄芪多糖对DTH模型小鼠耳组织形态学影响将耳片组织固定并进行HE 染色，结果如图1所示，NC组耳组织结构正常、分层清晰，MC组小鼠毛囊结构减少、真皮层大量炎症细胞浸润；APS能缓解表皮损伤，水肿程度减轻，炎症细胞浸润减少，其中APS-H组效果和DEX组相近。

1.4.6 实时荧光定量PCR 使用总RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)从脾脏组织中分离总RNA。然后使用cDNA第一链合成试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)进行逆转录。利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) Kit(Roche公司)通过引物序列进行扩增。引物设计见表2。反应体系见表3。反应条件如下：总反应体系 20 μL，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s。进行40个循环。每个样品重复3次，依据2-△△CT法计算各样本mRNA的相对表达量。GAPDH为内参基因。

表5 黄芪多糖对DTH模型小鼠肠道菌群的调节作用

2.5 黄芪多糖对DTH 模型小鼠脾脏中IFN-γ mRNA表达的影响如表6所示，MC组同NC组比较，IFN-γ的mRNA表达呈现升高趋势，差异有统计学意义(P<0.0001)；与MC组相比，APS-L组和APS-H组IFN-γ的mRNA表达呈现下降趋势，差异有统计学意义(P<0.0001)，APS-L组与APS-H组之间存在明显统计学差异(P<0.0001)。说明APS可以通过调节细胞因子mRNA的表达实现对机体免疫系统的调节作用，其中高剂量APS的效果更佳。

表6 黄芪多糖对DTH 模型小鼠脾脏中IFN-γ mRNA表达的影响

3 讨论

二硝基氟苯属于一种半抗原，其诱导的IV型超敏反应是由T细胞介导的以单个核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应，也称作接触性过敏反应，是指抗原进入机体使T细胞致敏，当再次接触相同致敏原后，特异性T淋巴细胞释放炎性因子，引起炎症反应。本实验结果显示：与NC组比较，MC组小鼠耳肿胀度与脾指数明显增高，细胞因子IFN-γ的mRNA表达也有所提高。由此可见DTH模型小鼠制备成功。

脾脏是机体最大的免疫器官，也是免疫反应的主要场所，可以清除机体内衰老细胞和微生物等物质，脾脏中大量T细胞、B细胞及巨噬细胞在机体免疫防御和清除功能中起到重要作用。因此测定脾脏指数可以反映机体的免疫功能状态。本实验中，与MC组相比，APS-L组与APS-H组的脾脏指数均显著下降，其结果显示机体淋巴细胞损伤或凋亡，说明APS可下调DTH 模型小鼠细胞免疫功能。此外，APS可显著降低小鼠的耳肿胀度，说明APS对机体的炎症反应具有抑制作用。

IFN-γ是典型的Th1型细胞因子，是炎症因子家族的成员之一，可以促进粘附分子的表达从而加重炎症反应程度[7]。Wakabayashi[8]经过研究证实在DTH模型小鼠炎症组织中IFN-γ的mRNA高表达，表明IFN-γ在DTH病程中起到重要作用。本实验中，MC组的IFN-γ mRNA与NC组相比，呈高表达，这与Wakabayashi 的研究结果一致。此外本实验表明APS可显著降低DTH模型小鼠脾脏中IFN-γ的mRNA表达，说明APS可以通过调节细胞因子IFN-γ的mRNA表达实现对机体免疫系统的抑制作用。

近年来肠道菌群成为多个学科研究的热点，不仅仅限于对肠道内疾病的影响，更多的是对肠道外疾病的影响，比如内分泌代谢疾病中的糖尿病[9]、精神障碍疾病中的抑郁症[10]等，肠道菌群微生态失调可能对许多疾病的病理进程都起着重要作用。本实验结果发现与NC组相比较，MC组小鼠肠道大肠杆菌和粪肠球菌数量明显增加，双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显减少，由此可见，DNFB诱导的IV型超敏反应模型小鼠肠道菌群出现失调。经黄芪多糖给药7 d后，肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显增多，肠杆菌和肠球菌数量减少，说明黄芪多糖可改善DNFB诱导的IV型超敏反应模型小鼠肠道菌群。

综上所述，黄芪多糖通过抑制细胞因子IFN-γ的mRNA表达和调节肠道菌群达到抑制DTH小鼠免疫反应，黄芪多糖高剂量组能较好地减轻DTH并改善DTH模型小鼠的肠道菌群。黄芪多糖抑制IFN-γ mRNA表达及调节肠道菌群的机制尚有待进一步研究。