夏奕，徐卫

（南京医科大学第一附属医院/江苏省人民医院血液科，江苏 南京 210029）

慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是一种以CD5+、CD19+B细胞在骨髓和外周血内克隆性聚集的B细胞恶性肿瘤[1]，绝大多数CLL细胞处于静息状态[2-3]。CLL患者预后异质性极大，部分患者呈惰性病程，终生无需治疗，而另一部分患者病程侵袭，早期就出现治疗指征、反复复发，甚至因CLL死亡。免疫球蛋白重链可变区突变状态（immunoglobulin heavy chain variable region，IGHV）、细胞遗传学异常{17号染色体短臂缺失[del（17p）]、11号染色体长臂缺失[del（11q）]、12号染色体三体（+12）、13号染色体长臂缺失[del（13q）]}、重现性基因（TP53、SF3B1、NOTCH1等）异常和CD49d、CD38、Zeta链相关蛋白-70（Zeta chain of T cell receptor associated protein kinase 70，ZAP70）的表达情况等均是影响CLL预后的重要因素[1]。

尽管目前CLL细胞起源至今仍有争议，但B细胞受体（B cell receptor，BCR）信号通路毫无疑问对维持CLL细胞生存、增殖、发展至关重要。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）是BCR信号通路的关键激酶，目前BTK抑制剂（Bruton tyrosine kinase inhibitors，BTKi）因其突出的疗效在CLL的治疗中得到广泛应用。本文综述BTKi在CLL中的作用机制和临床应用进展，以期为BTKi的基础研究和临床应用提供参考。

1 BTK与BCR信号通路

正常B细胞受抗原刺激后，BCR聚集，招募CD79α和CD79β并迁移至脂筏，使其与脂筏上密布的LYN激酶（SRC家族激酶成员）结合，LYN激酶磷酸化CD79α/β异二聚体，导致脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）的招募和磷酸化。活化的SYK和LYN进一步磷酸化免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs），导致下游BTK和磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）的活化。BTK一旦激活，即激活下游磷酸化磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2），进一步扩大BCR信号。这些BCR信号通路早期事件触发下游信号通路分子活化，从而活化包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、蛋白激酶Cβ（protein kinase C β，PKCβ）、B淋巴细胞瘤因子10（B cell lymphoma-10，BCL10）/凋亡蛋白酶募集结构域家族成员11（caspase recruitment domain family member 11，CARD11）/黏膜相关淋巴组织淋巴瘤转运蛋白1（mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1，MALT1）及钙离子流等在内的激酶及信号通路，引起核因子-κB（nuclear factor κ-B，NF-κB）、原癌基因MYC（MYCprotooncogene，MYC）、活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）等因子介导的转录激活，最终促进包括整合素活化、趋化因子介导的细胞迁移及B细胞增殖、分化、凋亡等在内的一系列细胞生理活动[4]。因此，抗原介导的BCR信号通路活化是正常B细胞介导体液免疫的基础。

BTK由659个氨基酸构成，包含5个结构域，从N端到C端依次为PH结构域（pleckstrin homology domain）、TH结构域（TEC homology domain）、SH3结构域（SRC homology 3 domain）、SH2结构域（SRC homology 2 domain）和催化域。BTK有2个关键的酪氨酸磷酸化位点，分别是位于SH3结构域上的酪氨酸223（Y223）和位于催化域上的酪氨酸551（Y551）。在BCR信号通路激活时，SYK通过磷酸化Y551增强BTK的催化活性，促使后续Y223的自身磷酸化[4-6]。由于BCR在CLL信号转导的重要作用及BTK在BCR信号通路中的中心作用，靶向抑制BTK成为治疗B细胞肿瘤的合理策略。目前所有的共价和非共价的BTKi均结合于BTK的催化域，通过抑制Y223的自身磷酸化发挥作用[7]。其中共价BTKi通过不可逆地结合于BTK活性位点的半胱氨酸481（C481）从而抑制Y223的自身磷酸化来阻止BTK的完全激活，抑制下游信号；而非共价BTKi与BTK的结合呈可逆性、不依赖C481活性位点，例如ARQ 531就是通过与谷氨酸475（E475）和酪氨酸476（Y476）残基形成氢键与 BTK非共价性结合，占据ATP结合口袋，抑制BTK的自身磷酸化，因此可能克服因BTKC481突变导致的共价BTKi的获得性耐药问题[8-10]。

2 CLL中BTKi的作用机制

CLL细胞在体内能存活很长时间，但分离纯化的CLL细胞在体外培养时会迅速发生自发性凋亡，提示肿瘤微环境促进CLL细胞的存活，阻止其凋亡[11]。CLL肿瘤微环境由T细胞、单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞和间充质基质细胞以及自然杀伤（natural killer，NK）细胞等构成[12]。与CLL细胞共培养，无论是未经纯化的骨髓基质细胞，还是纯化后的哺育样细胞（nurse-like cell，NLC）、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、滤泡树突细胞（follicular dendritic cells，FDC），均能保护CLL细胞免于死亡[13-16]。在实际用药过程中，BTKi见效的最初表现并非快速而直接的肿瘤细胞杀伤作用，而是使肿瘤细胞从淋巴结释放至外周血的再分布现象，提示此类药物可能通过阻断肿瘤细胞与微环境的相互作用发挥疗效[5]。以下以研究最早、最详尽的BTKi伊布替尼为例，阐述CLL中BTKi的作用机制。

CLL细胞经伊布替尼处理后，BTK磷酸化明显受抑制，下游ERK1/2、PI3K和NF-κB相关的生存信号也被阻断[17]。然而体外试验中，经伊布替尼处理的CLL细胞凋亡并不明显，且当外周血CLL细胞与基质细胞共培养时，由伊布替尼引起的细胞凋亡率更低。研究者利用重水同位素示踪技术，观察了30名CLL患者体内伊布替尼对肿瘤细胞增殖和死亡的直接效应，发现伊布替尼可有效降低CLL细胞的增殖率，同时提高外周血CLL细胞死亡率，且组织中CLL细胞死亡率比外周血中更高，提示机体不同组织的微环境可能对伊布替尼的疗效产生一定影响[18]。

趋化因子配体3（C-C motif chemokine ligand 3，CCL3）和CCL4是CLL细胞分泌的趋化因子，CLL细胞通过分泌CCL3和CCL4招募T细胞及其他辅助细胞，构建利于肿瘤细胞生存和增殖的微环境。BCR信号通路活化可促进CLL细胞CCL3和CCL4的分泌，为肿瘤细胞提供生存信号。对伊布替尼用药过程中的CLL患者实时监测发现，伊布替尼可快速、显著并持续地降低患者血清中包括CCL3、CCL4等在内的多种趋化因子水平[19]。Göckeritz等[20]对B细胞株内分别转染伊布替尼耐药的BTK C481S突变基因或野生型BTK基因，再分别应用伊布替尼处理，发现虽然用药前后2组细胞生长和凋亡率并无显著差异，但伊布替尼用药后BTK野生型细胞CCL3、CCL4的分泌显著下降，而BTK突变型细胞CCL3、CCL4的水平则不受影响，证明伊布替尼可通过调控CLL细胞中细胞因子的分泌达到治疗效果。

此外，CLL细胞表面高表达趋化因子受体CXCR4（C-X-C motif chemokine receptor 4）、CXCR5、趋化因子受体CCR7（C-C motif chemokine receptor 7），其相应的配体趋化因子CXCL12（C-X-C motif chemokine ligand 12）、CXCL13、CCL19则主要由骨髓MSC、NLC和FDC分泌。CLL细胞通过趋化作用向这些辅助细胞形成的保护性微环境迁移，免于被抗肿瘤药物杀伤。伊布替尼通过抑制CXCR4-CXCL12、CXCR5-CXCL13、CCR7-CCL19轴，使CLL细胞脱离淋巴结、脾、骨髓中保护性的微环境，促进CLL细胞被释放入外周血，更易于被抗肿瘤药物杀伤[21]。

除了对CLL细胞本身的作用外，BTKi还可作用于CLL微环境中的其他辅助细胞。例如，BTK表达于单核细胞和巨噬细胞，并在其分化过程中起重要作用[22]。伊布替尼促进CLL患者单核细胞脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症反应的恢复和抗原递呈[23]。伊布替尼的长期应用也与CLL患者单核细胞人白细胞DR抗原（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）的表达增高相关[24]。伊布替尼还通过阻碍Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）信号通路维持单核细胞来源的NLC的M2样表型[25]，并通过改变巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）诱导的单核细胞向纤维样细胞的分化，降低其黏附、吞噬作用，同时促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成[26]。以上证据表明，BTK调节单核细胞分化和巨噬细胞极化。BTK敲除的巨噬细胞更倾向于向M2样表型分化，同时NF-κB活化减低、磷酸化肌醇-5'-磷酸酶1的Src同源物2（Src homology 2-containing inositol-5'-phosphatase 1，SHIP1）的表达增加[27]。此外，还有研究发现，伊布替尼可抑制单核细胞和巨噬细胞分泌各类炎症因子、趋化因子和干扰素，阻断CLL细胞对基质细胞的黏附作用，从而促进CLL细胞从肿瘤微环境中的解离[28-29]。

CLL中，T细胞常呈免疫抑制状态。T细胞表达白介素IL-2诱导的T细胞激酶（interleukin-2-inducible kinase，ITK），而ITK结构与BTK相似，因此可被伊布替尼的“脱靶”效应抑制其功能。体外实验中，伊布替尼诱导T细胞向辅助性T细胞1（T-helper 1，Th1）细胞分化，同时抑制Th2细胞活化，表现出一种潜在的抗癌效应[30]。CLL患者在用伊布替尼过程中表现出包括外周血CD4+和CD8+T细胞程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1） 表达显著降低、Th17细胞比例降至正常、T细胞多样性增加等一系列免疫恢复的征象[29,31]。Long等[32]报道的伊布替尼诱导的T细胞亚群变化包括：CD4+和CD8+T细胞数量增加、效应记忆T细胞扩增、调节T细胞比例下降等，而初始T细胞和中心记忆T细胞数量减少。目前伊布替尼与PD-1/程序性死亡受体1配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）抑制剂的协同作用也初步在临床前试验中得到证实[33]。此外，伊布替尼与抗原嵌合受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）联用也取得了良好的初步结果：CAR-T对伊布替尼耐药的高危CLL患者有效，且在体外实验中伊布替尼连续应用可促进抗CAR-T细胞的扩增[34-37]。

CLL中NK细胞功能同样受损。BTK与ITK在NK细胞发育成熟及活化过程中起重要作用。伊布替尼治疗过程中，外周血中CD16+NK细胞数量保持不变，但CD16-不成熟NK细胞数量下降[38]。体外实验中，伊布替尼可抑制NK细胞的激活和NK细胞的抗体依赖性细胞毒性（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）以及巨噬细胞或中性粒细胞的吞噬作用，导致CD20单抗疗效降低[39-40]。目前认为此作用机制与伊布替尼“脱靶”抑制ITK的作用有关，因而在阿卡替尼（acalabrutinib）、泽布替尼（zanubrutinib）等高度选择性BTKi上尚未观察到这一现象[37,39,41]。

3 BTKi治疗CLL的研究进展

自2013年全球首个BTKi伊布替尼上市以来，包括阿卡替尼、泽布替尼、奥布替尼等共价BTKi相继上市，广泛应用于CLL的治疗。可克服共价BTKi耐药及不良反应的非共价BTKi也纷纷进入临床试验，本节将重点介绍现有BTKi在CLL中的治疗进展。

3.1 共价BTKi

伊布替尼是全球首个获得美国食品和药品管理局（FDA）批准的共价、不可逆BTKi。临床研究RESONATE[42]、RESONATE-2[43]和ECOG 1912[44]分别确立了伊布替尼在复发性难治性（relapse/refractory，R/R）CLL、≥65岁老年初治（treatmentnaive，TN）CLL和≤70岁青年TN CLL中的治疗地位。近期一项结合4项临床试验的综合分析表明，即使在TP53基因异常的TN CLL中，使用伊布替尼治疗的4年无进展生存（PFS）率达79%、4年总生存（OS）率为88%[45]。因此，伊布替尼被推荐为TN、R/R和TP53异常的CLL患者的首选用药。但值得一提的是，ECOG 1912临床研究IGHV突变的CLL患者中，伊布替尼与氟达拉滨、环磷酰胺、利妥昔单抗（FCR）方案在PFS率和OS率上均无明显差异，提示FCR仍是IGHV有突变且无TP53基因异常的CLL青年患者的优选方案；而对于IGHV无突变的CLL患者，无论青年或老年，均应首选伊布替尼治疗[44]。

伊布替尼、阿卡替尼、泽布替尼、奥布替尼均为结合于C481位点的共价、强效BTKi。其中阿卡替尼、泽布替尼、奥布替尼作为新一代的共价BTKi，比伊布替尼具有更高的BTK选择性，不抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、ITK等肝细胞癌表达的酪氨酸激酶（tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma，TEC）的活性。在一项Ⅱ期临床试验中，研究者对33例伊布替尼不耐受的CLL患者采用阿卡替尼治疗，72%患者未再次发生与伊布替尼相关的不良反应，13%患者发生与伊布替尼相关的不良反应但程度降低。该试验中位随访19个月，客观缓解率（overall response rate，ORR）为76%，包括1例患者达到完全缓解（complete remission，CR）[46]。泽布替尼、奥布替尼的临床试验初步结果也提示，相比伊布替尼，新一代共价BTKi疗效相当，但房颤、出血等不良反应率更低[47]。目前泽布替尼对照伊布替尼的Ⅲ期临床试验ALPINE正在进行之中，结果令人期待[48]。表1总结了现有共价BTKi的Ⅲ期临床试验数据。

表1 已发表的共价BTKi治疗慢性淋巴细胞白血病的Ⅲ期临床试验结果Table 1 Published phase III studies of covalent BTK inhibitors for chronic lymphocytic leukemia

尽管共价BTKi的出现对CLL的治疗是里程碑式的革新，但单药共价BTKi治疗CLL难以达到微小残留病灶（minimal residue disease，MRD）阴性，且不可停药，在造成患者经济负担的同时，也考验

患者对药物的耐受性。因此，将BTKi和免疫化疗或其他新药联用，以期达到CLL MRD阴性，从而达成“有限期”治疗，也是目前CLL治疗探索的重点之一。无del（17p）的TN CLL青年患者中，伊布替尼联合FCR（IFCR）方案使得33%患者在化疗结束后2个月评估时获得骨髓MRD阴性的CR，在整个研究过程中，84%的患者实现了骨髓MRD阴性的最佳疗效[55]。在另一项伊布替尼联合氟达拉滨、环磷酰胺、奥妥珠单抗（IFCG）方案治疗IGHV有突变且无TP53异常的TN CLL青年患者的临床试验中，98%的患者实现了骨髓MRD阴性，3年PFS率和OS率均高达98%[56]。与此同时，BTKi与BCL2抑制剂（BCL2 inhibitors，BCL2i）维奈妥拉联合应用也取得令人鼓舞的效果。在CLARITY研究中，R/R CLL患者接受伊布替尼和维奈妥拉（IV）方案治疗的ORR为89%，CR率为51%，36%患者获得了骨髓MRD阴性[57]。在另一项IV方案治疗高危和老年TN CLL患者的临床试验中，88%患者达到CR，61%患者达到骨髓MRD阴性[58]。CAPTIVATE临床试验评估了70岁以下TN CLL患者中IV方案的有效性。该试验中，经过12周期的IV联合治疗，75%的患者实现了外周血MRD阴性，68%的患者获得骨髓MRD阴性；其中外周血MRD阴性的患者中94%同时骨髓MRD阴性；外周血与骨髓MRD均为阴性的患者停止所有治疗后1年无病生存（disease free survival，DFS）率为95%，与继续伊布替尼维持治疗的患者无显著差异，进一步肯定IV方案是一种有潜力的“有限期”治疗方案[59]。此外，多种BTKi、BCL2i和CD20单抗三药联合的临床试验也在进行中[60]。

3.2 非共价BTKi

BCR通路相关基因异常，包括BTK C481、T474突变，PLCG2 R665W、S707突变、8号染色体短臂缺失[del（8p）]等导致的耐药是所有共价BTKi存在的普遍问题[61-64]，难以被现有疗法克服。此外，尽管新一代共价BTKi对BTK的选择性更高、脱靶可能性更小，但仍有高比例的头痛、腹泻等不良事件（adverse event，AE）的报道[65]。非共价BTKi不结合于BTK C481，为BTK C481等基因突变而导致共价BTKi耐药的CLL患者提供了全新的选择。这些非共价BTKi也可以应用于从未接受过BTKi治疗的患者从而减少获得性耐药。此外，非共价BTKi也可能减少因“脱靶”效应而产生的副作用。现有非共价BTKi包括fenebrutinib（GDC-0853）、ARQ531和pirtobrutinib（LOXO-305）等。

Fenebrutinib是一种不结合于BTK C481的高度选择性的可逆性非共价BTKi。与伊布替尼不同，fenebrutinib既不抑制EGFR，也不抑制ITK，保留了CD20单抗所依赖的NK细胞介导的ADCC[60]。正因如此，fenebrutinib作为单药使用和（或）CD20单抗联合均有良好的应用前景。Fenebrutinib在针对R/R B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin’s lymphoma，B-NHL）的Ⅰ期临床试验中，以100、200 和400 mg每天1次的剂量给药尚未达到最大耐受剂量（maximal tolerable dose，MTD）；最常见AE包括疲劳（37%）、呕吐（33%）、腹泻（29%）、血小板减少（25%）和头痛（20%）；24例患者中8例获得ORR，7例获得部分缓解（partial response，PR）或伴有淋巴细胞数量增高的部分缓解（partial response with persistent lymphocytosis，PR-L）；5例存在BTK C481S突变的患者中，1例获得PR，2例肿瘤体积缩小；所有获得缓解的CLL患者中位疗效持续时间为2.5个月，但该研究的MTD尚未达到，疗效还有提升空间[66]。

ARQ531是可逆的、非共价性结合的BTKi，通过占据BTK催化域内的ATP结合区域抑制BTK活性，不与BTK C481相互作用。ARQ531不仅对野生型和突变型BTK同样具有抑制作用，还抑制SRC家族激酶、ERK和AKT活性。在体外实验中，ARQ531可杀伤因PLCG2突变而造成伊布替尼耐药的CLL细胞。体内实验中，ARQ531对CLL和Richter转化鼠模型的疗效优于伊布替尼[8]。ARQ531的Ⅰ期剂量爬坡临床试验入组40例R/R B-NHL患者，10例获得PR（包括7例CLL和1例Richter转化患者）。目前以65 mg每天1次ARQ531为剂量扩展组的Ⅰb期临床试验正在进行中[67]。

Pirtobrutinib是新一代可逆的、非共价性结合的BTKi。Pirtobrutinib在纳摩尔级别即对BTK产生高度选择性的抑制作用，脱靶效应极低。即使是在高增殖性的肿瘤中，pirtobrutinib仍可克服BTK的高周转率（turnover），充分抑制BTK的活性。Pirtobrutinib可以抑制所有突变型BTK（C481S、C481T、C481R）Y223的自身磷酸化。在最新发表的多中心Ⅰ/Ⅱ期BRUIN临床试验中，323例患者接受了7个剂量等级的pirtobrutinib治疗（25、50、100、150、200、250和300 mg，每天1次），试验中未发生剂量限制性毒性；Ⅱ期临床试验采用200 mg每天1次的剂量，常见AE包括疲劳（20%）、呕吐（17%）和淤青（13%），最常见的Ⅲ级AE为粒细胞缺乏（10%），未观察到3级以上房颤，5例（1%）患者因治疗相关不良反应停药；在121例可评估疗效的既往接受过共价BTKi治疗的R/R CLL/SLL患者中，pirtobrutinib治疗ORR为62%；pirtobrutinib在既往共价BTKi耐药、不耐受和BTK C481突变、BTK野生型组中ORR相似[68]。

4 结语

综上，BTKi的出现彻底革新了CLL的治疗方式，它通过靶向BCR及其下游的信号通路抑制肿瘤细胞的生存和增殖，同时还通过影响肿瘤微环境中的单核巨噬细胞、T细胞和NK细胞，促进CLL细胞从保护性的肿瘤微环境中解离。包括伊布替尼、阿卡替尼、泽布替尼、奥布替尼等在内的共价BTKi在临床上已得到广泛应用，成为TN、R/R、存在TP53基因异常的CLL患者的首选治疗选择，大大改善了具有IGHV无突变、TP53基因异常等不良预后因素的CLL患者的预后。此外，BTKi与化疗或BCL2i等其他新型靶向治疗药物的联合方案提高了骨髓MRD阴性率，使得有限期治疗成为可能。另一方面，非共价BTKi的出现则为共价抑制剂获得性耐药和不耐受的患者提供了新的曙光，未来更多临床试验的结果值得期待。