刘 雨，席 辉，付英杰，李 鹏，卢斌斌，孙世豪，宗永立

中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南 郑州 450001

天然香料是以植物、动物或微生物为原料，经物理方法、酶法、微生物法或传统的食品工艺法加工制得，在食品、化妆品、烟草和医疗等领域有着广泛的应用[1-4]。天然香料作为添加剂中非常重要的一类，在食品和化妆品中应用广泛，例如浸膏和浓缩物等因其优异的感官特性，广泛用于化妆品和香皂等的生产中[5]；精油可以作为呈味剂、保鲜剂和抗菌剂丰富食品的风味并延长保质期[6-8]。水溶性糖是天然香料化学构成中的重要一类，主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖醇、山梨糖醇、麦芽糖、麦芽三糖和肌糖醇等[9-13]。研究表明：果糖、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖影响食品的硬度、嚼劲、弹性等质构特性[14-15]；水溶性糖可与水和香气化合物相互作用，通过盐析效应、疏水相互作用和氢键等影响香气化合物的释放，进而影响果汁和饮料的香气和风味[16-17]。因此，水溶性糖与天然香料和食品的感官品质特征联系密切。

天然香料中水溶性糖的分布特征通常受到原料种类和提取方式等因素的影响[18]，了解其分布特征对于天然香料的实际应用和品质评价具有重要的指导意义[19-20]，但相关的研究报道并不多。水溶性糖的分析检测主要是采用气相色谱-质谱法[21-22]、高效薄层色谱法[23]、高效液相色谱(HPLC)法[24-25]和核磁共振氢谱法[26-27]等技术，其中HPLC法因为前处理简单、准确度高和重复性好得到较多关注。基于此，作者以自制天然香料为研究对象，建立天然香料中常见的8种水溶性糖的高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)同步分析方法，考察了市售天然香料中水溶性糖的分布特征。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天然香料样品：樱桃汁浓缩物、树苔浸膏、菊苣浸膏、巴拉圭茶提取物、大枣提取物、山楂酊、圆柚精油、桂花精油、西梅提取物、玫瑰精油、玫瑰净油和紫罗兰净油均由实验室自制；菠萝汁浓缩物、苹果汁浓缩物、红枣净油1、葫芦巴净油、香荚兰净油、丁香花蕾油、茉莉浸膏、甜橙精油和树兰花酊：爱普香料集团股份有限公司；葡萄汁浓缩物、杨梅汁浓缩物、酸枣浸膏、西梅浸膏、树苔提取物、紫花苜蓿提取物、枣子酊剂、茶花酊、无花果精油1和红枣净油2：上海致朴实业有限公司；黑加仑浓缩物、春黄菊浸膏、香兰叶浸膏、无花果提取物、菊苣提取物、乌梅酊、柠檬精油、无花果精油2和蜡菊净油：上海祺源香精香料有限公司；桂花浸膏、大枣提取物、独活酊、苦杏仁精油、树苔净油和芸香净油：江西宝林天然香料有限公司。存放条件：(4.0±0.5)℃、RH(85±2)%。

乙腈(色谱纯) ：德国Meker公司；果糖(纯度≥99%)、葡萄糖(纯度≥99.5%)、蔗糖(纯度≥99.5%)、麦芽糖一水合物(纯度≥99%)、麦芽三糖(纯度≥99%)、肌糖醇(纯度≥99%)、山梨糖醇(纯度≥99%)：美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

UltiMate 3000液相色谱仪、超纯水仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；2000ES ELSD检测器：美国Alltech公司；Prevail Carbohydrate ES色谱柱(5 μm, 250 mm×4.6 mm)：美国Grace公司；CP2245电子天平(感量0.000 1 g)：德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES色谱柱(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)；流动相：乙腈和水；梯度洗脱：80%乙腈+20%水 (0 min)，80%乙腈+20%水(20 min)，75%乙腈+25%水(24 min)，55%乙腈+45%水(26 min)，55%乙腈+45%水(33 min)，80%乙腈+20%水 (37 min)，80%乙腈+20%水 (40 min)；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；ELSD：漂移管80 ℃；氮气流量：2.2 L/min。

1.3.2 标准工作溶液的配制

准确称取8种水溶性糖于25 mL容量瓶中，使用超纯水定容，混匀得到标准储备液，其中阿拉伯糖醇、山梨糖醇、肌糖醇、麦芽糖和麦芽三糖质量浓度分别为15.00 mg/mL，果糖、葡萄糖和蔗糖质量浓度分别为20.00 mg/mL；阿拉伯糖醇、山梨糖醇、肌糖醇、麦芽糖和麦芽三糖梯度稀释，分别配制7.5、15、30、75、300、600、1 500 μg/mL的标准工作溶液，果糖、葡萄糖和蔗糖梯度稀释，分别配制10、20、40、100、400、800、2 000 μg/mL的标准工作溶液。

1.3.3 样品前处理

称取待测天然香料样品0.100 0 g于50 mL离心管中，加入25 mL超纯水，室温条件下超声萃取15 min。提取液6 000 r/min离心10 min。取水相清液1 mL经0.45 μm滤膜过滤，作为进样溶液，进行阿拉伯糖醇、果糖、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖、肌糖醇、麦芽糖和麦芽三糖的HPLC-ELSD定量分析。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010软件对数据进行分析；使用SPSS 23.0对水溶性糖含量进行方差分析；使用Origin 2018对天然香料进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 建立HPLC-ELSD法分析水溶性糖

以阿拉伯糖醇、果糖、山梨糖醇、肌糖醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖等8种水溶性糖为目标物，在之前的工作基础上[28]，采用Prevail Carbohydrate ES色谱柱，进一步优化色谱条件，建立了分析水溶性糖的HPLC-ELSD方法。该方法可以将8种水溶性糖较好地分开，且峰形尖锐、对称、无拖尾现象(图1)，对天然香料初步分析的结果显示，所选择的8种水溶性糖在天然香料中均有分布。

1.阿拉伯糖醇；2.果糖；3.山梨糖醇；4.葡萄糖；5.蔗糖； 6.肌糖醇；7.麦芽糖；8.麦芽三糖图1 标准工作溶液和天然香料的色谱图Fig.1 Chromatograms of standard working solution and homemade natural fragrance and flavor ingredient

2.2 方法学评价

2.2.1 标准曲线、检出限和定量限

以目标化合物的色谱峰面积对质量浓度进行回归分析，得到8种水溶性糖的线性回归方程及相关系数；分别以3倍的信噪比和10倍的信噪比为方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表1。8种水溶性糖均呈现良好的线性关系，相关系数为0.999 2～0.999 9；LOD和LOQ分别为2.07～4.20 μg/mL、6.90～14.00 μg/mL，可以满足各目标物的定量检测需求。

2.2.2 精密度和回收率

选取基质相对复杂的浸膏样品，通过加标的方式考察方法的回收率和精密度。由表2可知，8种水溶性糖加标回收率在91.5%～98.9%之间，相对标准偏差(RSD)在1.06%～4.65%之间。说明本方法测定结果比较稳定，适用于天然香料中水溶性糖的分析。

2.3 天然香料中水溶性糖的分布特征

采用建立的方法对46种天然香料中的水溶性糖含量进行测定，并对其进行描述性统计分析，结果如表3所示，天然香料中检出频次最高的水溶性糖为葡萄糖和果糖，其次是麦芽糖、阿拉伯糖醇、蔗糖、山梨糖醇和麦芽三糖，阿拉伯糖醇仅在树苔浸膏和树苔提取物中检出，肌糖醇仅在菊苣浸膏中检出。所测定天然香料中水溶性糖的变幅和变异系数均比较高，离散程度大，表明不同的天然香料中水溶性糖的分布差异较大。

表1 8种水溶性糖的标准曲线、线性范围、LOD和LOQTable 1 Standard curves, linear ranges, LOD, and LOQ of 8 soluble sugars

表2 8种水溶性糖的加标回收率(n=5)Table 2 Spiked recoveries of 8 soluble sugars (n=5)

表3 天然香料中水溶性糖含量的描述性分析Table 3 Descriptive analysis of soluble sugars in natural fragrance and ingredient

2.4 不同品类天然香料中水溶性糖的分布特征

根据GB/T 21171—2018，天然香料可分为净油、精油、酊剂、提取物、浓缩物和浸膏等品类。按照相应的定义，精油和净油是从原料中提取得到的芳香油；酊剂是由可变浓度的乙醇或水浸渍原料得到的产物；浸膏、提取物和浓缩物在提取过程中均经过浓缩。因此理论上精油和净油类天然香料产品中不应含有水溶性糖；酊剂类产品中可能不含或含有少量水溶性糖；而浸膏、提取物和浓缩物类产品中可能含有较多的水溶性糖。

为了进一步考察不同品类天然香料中水溶性糖的实际分布特征，以天然香料中8种水溶性糖含量为变量，对46种天然香料进行聚类分析(图2)。以欧式距离70为临界值，总体上不同品类的天然香料可分为三大类，浓缩物、大部分提取物和部分浸膏为第1大类；精油、净油、酊剂、部分浸膏和部分提取物为第2大类；树苔浸膏和树苔提取物为第3大类。

图2 天然香料中水溶性糖含量的聚类分析树状图Fig.2 Cluster tree analysis for soluble sugars content in natural fragrance and flavor ingredient

第1大类主要包括所有的浓缩物、酸枣浸膏、无花果浸膏、西梅浸膏、西梅提取物、大枣提取物、无花果提取物、无花果精油1和红枣净油1，其表现为含有大量水溶性糖。但是净油和精油中不应含有水溶性糖，这提示无花果精油1和红枣净油1可能存在标签误贴或命名错误。第2大类主要包括精油、净油、酊剂等不含有或含有少量水溶性糖的天然香料。以欧式距离45为临界值，第2大类又可以分为3个亚类：第1亚类包括精油、净油、桂花浸膏和茉莉花浸膏，其表现为不含水溶性糖，茉莉花浸膏和桂花浸膏通常是由有机溶剂提取得到[29-30]，所以被聚为第1亚类；第2亚类和第3亚类包括水溶性糖含量较低的浸膏、酊剂和提取物。第3大类包括树苔浸膏和树苔提取物，表现为仅含有阿拉伯糖醇，其仅天然存在于地衣和蘑菇中[13]，提示水溶性糖的分布特征或可作为天然香料真实性鉴别的依据。

不同品类天然香料中水溶性糖含量如表4所示，浓缩物中果糖(254.68 mg/g)和葡萄糖(217.02 mg/g)含量最高，其次是提取物和浸膏，酊剂中果糖和葡萄糖含量最低，分别为16.40 mg/g和18.99 mg/g。浓缩物中果糖和葡萄糖含量显著高于其他品类市售天然香料中果糖和葡萄糖含量；浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量显著高于酊剂中果糖和葡萄糖含量。不同品类天然香料中水溶性糖的分布特征或可作为天然香料品质特征评价和真实性鉴别的指标之一。

表4 不同品类天然香料中水溶性糖的含量Table 4 Content of soluble sugars in different species of natural fragrance and flavor ingredient

2.5 不同原料种类天然香料中水溶性糖的分布特征

根据原料种类不同，把不同品类天然香料进一步分为水果类香料和植物花叶类香料[31]，进一步探讨水果类香料和花叶类香料中水溶性糖的分布特征(表5)。以水果为原料的香料中葡萄糖和果糖含量均高于以花叶为原料的天然香料，其他水溶性糖含量无显著性差异。

表5 不同原料种类天然香料中水溶性糖的含量Table 5 Content of soluble sugars in natural fragrance and flavor ingredient with different raw materials

在以水果为原料的天然香料中，浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量显著高于酊剂中果糖和葡萄糖含量，浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量无显著性差异。提取物中果糖(269.50 mg/g)和葡萄糖(212.04 mg/g)含量最高，其次是浸膏，酊剂中果糖和葡萄糖含量最低，分别为32.81 mg/g和37.97 mg/g。在以花叶为原料的天然香料中，浸膏、酊剂和提取物中果糖和葡萄糖含量均无显著性差异。浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量互有高低，酊剂中未检出水溶性糖。不同原料种类天然香料中水溶性糖的分布特征对调香时天然香料的选用具有参考价值。

3 结论

本研究建立了一种同时测定天然香料中果糖、葡萄糖、阿拉伯糖醇、山梨糖醇、麦芽糖、麦芽三糖、肌糖醇和蔗糖的HPLC-ELSD分析方法。该方法检出限低、重复性好、回收率高，分析性能良好，适用于天然香料中水溶性糖的分析。以往的研究工作大多聚焦于不同品种的相同物质的水溶性糖的分布，本研究采用所建立的方法分析了不同品类和不同原料种类的天然香料。结果表明，天然香料中主要的水溶性糖是果糖和葡萄糖，天然香料中水溶性糖含量的变幅和变异系数均比较高，离散性大；浓缩物中果糖和葡萄糖含量显著高于其他品类市售天然香料中果糖和葡萄糖含量；浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量显著高于酊剂中果糖和葡萄糖含量。部分净油和精油样品中检出大量水溶性糖，表明天然香料可能存在标签误贴或命名混乱的现象。以水果为原料的香料中葡萄糖和果糖含量均高于以花叶为原料的天然香料，其他水溶性糖含量无显著性差异，以花叶为原料的天然香料中，浸膏、酊剂和提取物中果糖和葡萄糖含量均无显著性差异。天然香料中水溶性糖的分布特征对天然香料的品质评价和实际应用具有指导性意义，同时为建立天然香料液相色谱指纹图谱真实性鉴别技术奠定了良好的工作基础。