刘 骅，王花花，王 珺，宫文武，丁 震，孙 备，许雷鸣，蒲 江

(1.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051；2.安徽智飞龙科马生物制药有限公司，安徽 合肥 230088； 3.安徽省药品监督管理局，安徽 合肥 230051；4.安徽医科大学第三附属医院，安徽 合肥 230001)

重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)是由中国科学院微生物研究所和安徽智飞龙科马生物制药有限公司联合研发的新冠病毒疫苗，也是目前世界唯一的重组型新型冠状病毒疫苗。原理是将新冠病毒S蛋白受体结合区(RBD)即抗原蛋白基因重组到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内，在体外表达形成RBD二聚体，再加氢氧化铝佐剂以提高免疫原性。2021年3月10日批准在中国国内紧急使用。重组新型冠状病毒疫苗生产采用工程化细胞(CHO)生产重组蛋白，该技术已在乙肝疫苗中使用，技术成熟，不需要高等级生物安全实验室和生产车间，生产工艺稳定可靠，可快速实现大规模产业化生产，显著降低疫苗生产成本，且存储和运输便捷。

注射剂内毒素检测方法的灵敏性及可靠性直接关系到用药者的生命安全，特别是疫苗这一类用于健康人群接种的特殊药品，内毒素的控制更为严格，内毒素的控制不仅是作为注射类药品的控制要求，也是疫苗不良反应的原因之一[1]。重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)现行内毒素检查标准是采用凝胶法。我们基于：(1)对内毒素控制进一步量化，产品质量控制更加严格；(2)目前鲎被列为国家二级保护动物，2019年3月世界自然保护联盟(IUCN)正式宣布中华鲎“濒危”[2]。意味着内毒素检测试剂原料将受到严格管控[3]。因此,寻求替代测试方法或者减少鲎试剂使用的方法迫在眉睫。本研究采用了微量鲎试剂动态显色法对该疫苗进行内毒素定量检测，并与现行凝胶法进行比较。以期建立既节省鲎试剂又能定量检测该疫苗内毒素的方法。

1 材料

1.1 药品与试剂重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)，批号：A202105106、B202107162、D202107092，规格：1.0 mL每瓶(安徽智飞龙科马生物制药有限公司)。细菌内毒素工作标准品，批号：150601-201987，规格：80 EU每支(中国食品药品检定研究院)。动态显色法(微量技术)鲎试剂，批号：2104080，规格：0.35 mL每支，定量范围：10～0.01 EU·mL-1(湛江安度斯生物有限公司)。凝胶法鲎试剂，批号：20091812，灵敏度：0.25 EU·mL-1，规格：0.1 mL每支(福州新北生化工业有限公司)。细菌内毒素检查用水(BET水)，批号：2002260，规格：50 mL每瓶(湛江安度斯生物有限公司)。

1.2 仪器细菌内毒素检查96孔反应板(批号210106，湛江安度斯生物有限公司)；全自动细菌内毒素检测系统，Endo Probe Robot 100(湛江安度斯生物有限公司)；混旋仪，型号MS3digital(IKA公司)，内毒素凝胶法测定仪(天津天大天发科技有限公司)。

2 方法[4-8]与结果

2.1 细菌内毒素的限值企业标准规定：应小于10 EU·mL-1。

2.2 微量鲎试剂动态显色法标准曲线可靠性试验及凝胶法鲎试剂灵敏度复核

2.2.1微量鲎试剂动态显色法标准曲线可靠性试验 取细菌内毒素工作标准品1支(80 EU每支)，加入1.0 mL BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15 min，得到细菌内毒素初始浓度溶液(80 EU·mL-1)，用BET水将细菌内毒素工作标准品稀释成2.0、0.2、0.02 EU·mL-13个浓度的内毒素标准溶液，同时设立阴性对照管。取4支动态显色法鲎试剂，按照说明书要求，分别加入0.35 mL BET水复溶内容物，吸取25 μL鲎试剂，加至96孔反应板上，分别加上述系列浓度细菌内毒素标准溶液25 μL与鲎试剂进行反应。每个浓度平行3管。软件预设吸光度OD值0.1，反应时间T为3 600 s，温度(37±0.5)℃，检测波长405 nm，以反应时间T的对数为横坐标，以浓度c的对数为纵坐标，绘制标准曲线，计算相关系数r值。根据鲎试剂动态显色法(微量技术)说明书的规定：标准曲线的相关系数 |r| 应≥0.980，CV系数≤20%，试验方为有效。测得数据经线性回归分析，得回归方程：lgT=-0.302 7 lgC+2.858 7，|r|= 0.998 9。变异系数均小于20%，标准曲线最低浓度均大于阴性对照管内毒素含量，标准曲线最低点反应时间为2 538 s。见Tab 1。

Tab 1 Reliability test results of kinetic chromogenic assay standard curve

结果表明，本次试验结果可信，线性可靠。批号为2104080的鲎试剂动态显色法(微量技术)符合要求。

2.2.2凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验 用BET水将细菌内毒素工作标准品溶解，置混旋仪混合15 min，依据中国药典2020年版四部通则1 143方法进行灵敏度复核试验，见Tab 2。

Tab 2 Sensitivity recheck test results of TAL(gel-clot method)

结果表明：鲎试剂灵敏度在0.5～2.0λ(含0.5λ和2. 0λ)之间，符合中国药典2020年版规定。

2.3 供试品动态显色法干扰预试验按“2.2.1”项下方法制备0.4 EU·mL-1内毒素标准溶液，取供试品原液用BET水稀释至10倍、20倍、40倍，分别与0.4 EU·mL-1内毒素标准溶液等体积混合，得到稀释倍数为20倍、40倍、80倍的内毒素终浓度为0.2 EU·mL-1供试品阳性对照溶液，用动态显色法进行预试验。见Tab 3。

Tab 3 Interference pre-test results

结果表明：供试品稀释至20、40、80倍时，回收率均在50%～200%，重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)在稀释20倍及以上浓度时，对鲎试剂与细菌内毒素的反应无干扰作用，可进行正式干扰实验。

2.4 供试品动态显色法干扰试验本试验标准曲线中细菌内毒素的浓度为2.0、0.2、0.02 EU·mL-1，根据最大有效稀释倍数MVD=cL/λ，供试品限值L按10 EU·mL-1，λ按0.02 EU·mL-1，算得MVD为500倍。目前凝胶法中鲎试剂选用的灵敏度是0.25 EU·mL-1，计算稀释倍数为40倍。为方便这两个方法进行比较，综合各因素，我们选择稀释40倍来做正式干扰实验。

供试品溶液(溶液A)制备：用BET水将疫苗原液稀释40倍。

供试品阳性对照溶液(溶液B)制备：取稀释倍数为20倍的供试品溶液与等量的0.4 EU·mL-1内毒素标准溶液混合，即得稀释倍数为40倍内含0.2 EU·mL-1内毒素的供试品阳性对照溶液。

内毒素标准溶液(溶液C)制备：按“2.2.1”项下方法制备终浓度为2.0、0.2、0.02 EU·mL-13个浓度的内毒素标准溶液。

参照鲎试剂动态显色法(微量技术)说明书，取溶液A、溶液B、溶液C、溶液D(BET水作为阴性对照)各25 μL，分别与加至反应板内的25 μL微量动态显色法鲎试剂反应，每个浓度设置两个平行孔。反应条件同“2.2.1”项。按线性回归方程，计算溶液A的细菌内毒素含量(ct)和溶液B的细菌内毒素含量(cs)，将0.2 EU·mL-1内毒素浓度设为λm，再按下式计算回收率(R)。R应在50%～200%之间。

R =(cs-ct)/λm×100%

结果表明，重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)在稀释倍数为40倍时，3批供试品的回收率均在50%～200%，表明在该稀释倍数下对细菌内毒素及鲎试剂反应没有干扰作用，可进行内毒素定量检查。

2.5 供试品动态显色法检查根据干扰试验结果对供试品用BET水稀释40倍后进行细菌内毒素检测，方法同“2.4”项。见Tab 5。

Tab 4 Interference test results

Tab 5 Results of bacterial endotoxin (micro-dynamic chromogenic method)

结果表明：3批供试品的内毒素含量均小于限值10 EU·mL-1，符合企业质量标准要求。

2.6 供试品凝胶法细菌内毒素检查按中国药典2020年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”凝胶限度试验进行细菌内毒素检查[4]，结果见Tab 6。

Tab 6 Results of gel-clot test of the samples

结果表明：3批供试品的细菌内毒素检查均符合企业质量标准要求。

3 讨论

本研究采用微量鲎试剂动态显色法对3批重组新冠疫苗进行试验，测得内毒素含量均低于限值，与凝胶法检查结果一致。本研究中既考虑到鲎试剂的资源匮乏，选用微量鲎试剂检测，鲎试剂的使用量仅为传统方法的十分之一，大大减少了鲎试剂的使用。同时又采用定量方法对疫苗的成品内毒素进行含量检测，对内毒素的质量控制更加严格，进一步保障了人民用苗安全。所使用的全自动内毒素检测系统，消除了人工加样误差，更加高效便捷，提高检验效率。该方法可推广使用到该疫苗的原料、半成品及佐剂的内毒素检测中。