昂格力玛，宝苏日高，孟永梅

(内蒙古医科大学蒙医药学院蒙医基础实验中心，内蒙古 呼和浩特 010110)

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是一种慢性肾脏疾病，其特征是肾功能缓慢进行性下降，导致不可逆的肾硬化和肾单位丧失。近年来，CRF的发病率和死亡率明显上升，给社会带来了沉重的经济负担。在中国，2012年有1.195亿CRF患者，总患病率为10.8%[1]。CRF终末期的主要治疗方式是血液透析和肾移植，然而接受血液透析治疗的患者患癌症的总体风险更高[2]，肾移植方面虽取得了进展，但有限的肾脏来源限制了其应用。因此，从草药或食用药材中开发新的有效治疗或缓解CRF的药物势在必行。

肾间质纤维化是引起各种肾脏疾病发展为CRF的主要因素和重要环节，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在致纤维化细胞因子中作用最强，Smad蛋白是TGF-β家族的下游信号蛋白，且是最关键的下游调节因子，Smad蛋白的活化主要通过TGF-β的调节。Smad蛋白可以介导TGF-β在胞内传到过程。TGF-β/Smad信号传到通路在肾纤维化的过程中发挥重要的作用。所以通过抑制TGF-β活性，来拮抗或阻断TGF-β/Smad信号传导可以延缓肾纤维化的进展[3]。传统蒙药大黄-3汤由大黄、诃子、碱面配伍而成，常用于治疗腹胀[4]、便秘[5]、肥胖[6]和闭经[7]等。有研究发现大黄在改善慢性肾功能衰竭早期症状和延缓肾功能衰竭进展方面具有独特的优势[8]。潜在的机制包括抑制肾纤维化[9]、促进毒素排泄、恢复代谢紊乱[10]、保护肾细胞免受过度炎症和氧化应激损伤。本实验研究大黄-3汤对CRF大鼠肾组织TGF-β/Smad信号通路的影响，从抑制人肾小球系膜细胞(HMC)异常增殖、肾小管上皮细胞(HK-2)间质转化，抗纤维化等方面，探讨其延缓CRF进展的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物与细胞110只无特定病原体SPF健康雄性SD大鼠，体质量(200～220)g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。生产许可证号SCXK2006(北京)-0006。动物在内蒙古医科大学实验动物中心饲养，光照/黑暗周期为12 h/12 h，饲养温度为24～26 ℃，相对湿度为50%，实验期间给予标准食物和水，且不限量。

本研究中使用的人HMC和HK-2购自上海中科院。细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，温度37 ℃，加湿5% CO2培养箱中孵育。培养基每3 d更换一次。

1.2 仪器、药品及试剂全自动化分析仪(Accut-Toshiba, Japan)；冷冻干燥器(Telstar LyoQuest，西班牙)；免疫组化全自动染色机(莱卡，德国)；全自动玻片扫描仪(莱卡，德国)；BD流式细胞仪(Becton Dickinson, SanJose，USA)；罗氏LightCycler 96荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)；Jess多功能成像系统(Jess多功能全自动蛋白质免疫印迹定量分析系统，美国)。大黄购自国安市久旺药业有限公司(久旺，中国，翼20150011)；诃子购自河北联康药业有限公司(联康，中国，翼20140028)；碱面购自内蒙古草原大江食品有限责任公司(草原大江，中国，SC20115010400383)，以上药物由内蒙古医科大学蒙医药学院方剂教研室布和朝鲁老师鉴定为正品；腺嘌呤购自北京索莱宝科技有限公司(索莱宝，中国，513I054)；尿毒清颗粒购自康臣药业内蒙古有限责任公司(康臣，中国，Z20073256)；转化生长因子β1(TGF-β1)购自派普泰克生物科技(苏州)有限公司(PeproTech,美国，1218209)；生化检测试剂血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、24 h尿蛋白(CSF)购自北京利德曼生化股份有限公司(利德曼，中国)；胎牛血清(Biological Industries，美国)；RPMI 1640培养基(美伦生物，中国)；TriQuick总RNA提取试剂(索莱宝，北京，中国)；HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康为世纪，中国)；UltraSYBR Mixture(康为世纪，中国)；高效RIPA组织/细胞裂解液(索莱宝，北京，中国)；硝酸纤维素膜PVDF(索莱宝，北京，中国)；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Smad 3、增殖细胞核抗原(PCNA)、羊抗鼠抗体、羊抗兔抗体购自北京华安有限公司；E-钙粘蛋白(E-cadherin)购自美国abcam试剂有限公祠；Smad 2购自Cell Signaling Technology公司；beta-Tubulin购自美国Affinity Biosciences公司。

1.3 药物配制

1.3.1大黄-3汤 (1)煎煮:大黄、诃子粉碎过10目筛，各称取100 g，加100 g碱面混合(共300 g)，后加总重量的8倍量水(2 400 mL)浸泡12 h，加热煎煮3次，每次2 h，合并3次煎液。(2)浓缩:将提取液浓缩至生药量与药液体积比为1 ∶1.5。(3)冻干:在-80 ℃冻存12 h后在冷冻干燥器(Telstar LyoQuest，西班牙)中冻干至180 g冻干粉，大黄-3汤冻干粉在常温储存。临用时取相应体积添加超纯水配制0.675 g·kg-1(低剂量)、1.35 g·kg-1(中剂量)和2.7 g·kg-1(高剂量)剂量大黄-3汤。

1.3.2尿毒清颗粒 取相应体积的尿毒清颗粒添加超纯水制备1.8 g·kg-1浓度。

2 方法

2.1 动物分组及处理90只♂SD大鼠随机分为正常组(16只)和造模组(80只)两组。造模组以2.5%腺嘌呤混悬液按250 mg·kg-1· d-1连续灌胃14 d后, 再隔日给药14 d，共28 d。造模成功后，随机分为模型、阳药(尿毒清颗粒)、大黄-3汤低、中、高剂量组5组，每组15只。间隔给药共12周，正常组与模型组给予等体积的生理盐水。

2.2 实验细胞及处理含药血清制备：采用血清药理学方法，将20只雄性SD大鼠随机分为正常组(超纯水)和大黄-3汤组(5.4 g·kg-1)两组，每组通过灌胃法连续给药7 d，d 5和d 7末次给药后在0.5、1、2、3、4 h的时间段用乙醚麻醉后眼眶采血，12 500 r·min-1离心10 min，然后在56 ℃下加热30 min以灭活补体。随后，使用0.22 μm微孔膜对血液的血清部分进行无菌过滤，并储存在-80 ℃备用。

无论是食用香料还是食用香精，都属于食品添加剂范畴。可谈到“食品添加剂”这个词，中国百姓多要忌惮三分。2008年的三鹿婴幼儿配方奶粉食品安全事件，让更多的人开始关注食品添加剂，也让更多的人，尤其是母乳期的妈妈们，开始对“食品添加剂”一词避而远之。一夜之间，食品添加剂在受到前所未有关注的同时，也被打入冷宫。

将对数期的1×104细胞用D-PBS洗涤两次，接种在96孔板中，并与100 μL无血清培养基一起在37 ℃的加湿5% CO2培养箱中孵育24 h。随后，培养皿中的100 μL无血清培养基被分别含有0、0.1、1、2、4、5和10 mg·L-1的人TGF-β1的100 μL培养基替代，然后在37 ℃的加湿的5% CO2培养箱中48 h进行共培养。选择一个最有效的促进HMC异常增殖和HK-2间质转化的浓度诱导细胞，并同时给予大黄-3汤含药血清治疗细胞。

2.3 检测指标

2.3.1生化检测 将实验大鼠眼眶采血后的血样在3 000 r·min-1，4 ℃离心15 min，收集上清(血清)。按照试剂盒说明书测定血清中BUN、Scr含量。

2.3.2组织学分析 将大鼠左肾脏固定在4%多聚甲醛，石蜡包埋，厚3 μm切片,HE和Masson染色进，评估肾小球和肾小管间质的损伤程度。

2.3.3免疫组化分析 将制备的3 μm的切片在免疫组化全自动染色机进行PCNA(1 ∶1 000)和α-SMA(1 ∶1 000)染色，使用全自动玻片扫描仪进行扫描，评估PCNA、α-SMA的表达。

2.3.4Real-time PCR分析 采用TriQuick总RNA提取试剂从肾组织和肾小管上皮细胞中提取总RNA。利用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit将RNA逆转录为cDNA。使用UltraSYBR Mixture在罗氏LightCycler 96荧光定量PCR仪上进行扩增，并用2-ΔΔCt法计算。所有引物序列Tab 1所示。

Tab 1 Gene sequence

2.3.5蛋白免疫印迹分析 采用高效RIPA组织/细胞裂解液提取肾组织中的蛋白，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。蛋白质在10% SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜PVDF上，然后在室温下用5%脱脂奶粉将膜封闭3 h。膜与以下一抗在4℃孵育过夜：α-SMA(1 ∶1 000)、FSP1(1 ∶1 000)、Smad 2(1 ∶1 000)、Smad 3(2 ∶1 000)、E-cadherin(20 ∶1 000)、PCNA(1 ∶1 000)和beta-Tubulin(1 ∶1 000)。用TBST洗涤五次后，将膜与相应的羊抗鼠抗体(Goat anti-rat IgG-HRP，1 ∶1 000)和羊抗兔抗体(Goat anti-rabbit IgG-AP，1 ∶1 000)结合辣根过氧化物酶在室温下孵育2 h。最后用ECL试剂盒将PVDF膜在Jess多功能成像系统下成像，成像结束后将这些膜再次洗涤并使用增强型DAB显色试剂盒显色。用 ImageJ 1.48软件分析所有蛋白条带，计算各条带与beta-Tubulin灰度值的比值并统计分析各组差异。

3 结果

3.1 腺嘌呤诱导SD大鼠造模CRF模型造模期间每日记录各实验组的体质量,每周眼眶采血检测血清BUN和Scr，收集24 h尿液并检测24 h尿蛋白CSF。检测结果显示,造模4周期间，正常组大鼠体质量持续增加，造模组在造模前2周，每日灌胃腺嘌呤后体量下降，造模后2周造模组将每日灌胃改为隔日，体量逐渐增长，但增长速度仍然低于空白组(P<0.05)(Fig 1A)。造模4周结束后造模组大鼠BNN、Scr、24 h尿量均高于空白对照组(P<0.05)(Fig 1B-E),这一结果提示CRF模型造模成功。

Fig 1 Comparison of related indexes after adenine induced CRF rat A： Effects of adenine modeling on weight gain of experimental rats B：Effects of adenine on BUN of experimental rats C： Effects of adenine on Scr of experimental rats D： Effects of adenine on CSF of experimental rats E： Effects of adenine on 24 h urive volume of experimental rats. #P<0.05 vs normal group.

3.2 大黄-3汤对CRF大鼠尿液颜色的影响正常组大鼠尿液呈淡黄色，模型组大鼠尿液与正常组相比尿液颜色变深呈暗红色,大黄-3汤不同剂量治疗后CRF大鼠尿液颜色偏向于正常大鼠尿液颜色(Fig 2A)。

Fig 2 Effect of rhubarb-3 decoction on urine color (A) and renal function (B，C) of CRF rats(n=5)##P<0.01 vs normal group; **P<0.01 vs model group.

3.3 大黄-3汤对CRF模型大鼠肾功的影响生化检测BUN和Scr，与正常组相比，模型组BUN和Scr含量明显升高(P<0.01)，大黄-3汤低剂量能明显降低BUN水平(P<0.01)(Fig 2B)；大黄-3汤低、中剂量能明显减低Scr水平(P<0.01)(Fig 2C)。以上结果表明大黄-3汤能改善CRF大鼠肾功能。

3.4 大黄-3汤对CRF模型大鼠肾脏形态和病理的影响正常组肾脏呈马豆状，色泽鲜艳、光泽。模型组，肾脏肿大，白色颗粒广泛分布在表面，肾脏呈白霜状。与模型组相比，大黄-3汤肾脏体积变小且表面白霜外观减少(Fig 3A)。为证实大黄-3汤对CRF大鼠肾脏损伤的修复作用，采用HE和Masson染色分析大黄-3汤对CRF大鼠肾脏病理的影响。HE染色结果显示，正常组肾皮质和髓质结构完整，界限清晰；肾小管上皮细胞排列整齐，结构完整；肾小球体积均匀，血管球较大，肾小囊囊腔较窄。模型组肾皮质和髓质散在或弥漫分布多核巨细胞和肉芽肿，很多肉芽肿周围明显纤维化而形成大小不等的纤维化病灶，灶内淋巴细胞浸润和肾小管萎缩和消失。纤维化病灶间的肾小管上皮细胞增生，管腔扩张而轻度代偿性肥大。肾小球血管球体积明显缩小，个别纤维化灶内肾小管腔内可见较多中性粒细胞。药物治疗后这些现象相对减轻(Fig 3B)。Masson染色结果显示，正常组肾小管间质、肾小囊囊壁和血管球内见均匀的细线状蓝染的胶原纤维。模型组皮质和髓质纤维化病灶内蓝染的胶原纤维数量多，纤维束较粗，面积较大。药物治疗组皮质和髓质纤维化病灶内肾小囊囊壁、肾间质蓝染的胶原纤维数量减少、纤维束变细、面积减小(Fig 3C)。

3.5 大黄-3汤对CRF模型大鼠肾组织PCNA和α-SMA表达的影响肾小球系膜细胞异常增殖在肾纤维过程中起着重要作用,肾纤维化会导致纤维化标志物α-SMA的表达水平增加。与正常组相比，模型组大鼠肾组织中PCNA和α-SMA的蛋白表达显著增加，尿毒清颗粒和大黄-3汤治疗能显著降低PCNA和α-SMA蛋白的表达(Fig 3D，E)。

Fig 3 Effect of rhubarb-3 decoction on renal pathological changes and expression of PCNA and α-SMA in CRF rats(A) The effect of rhubarb-3 decoction on color, appearance and morphology of kidney tissues in CRF rats. (B) HE staining. (C) Masson staining. (D) Immunohistochemical analysis of PCNA . (E) Immunohistochemical analysis of α-SMA (B，C，D，E×400).

3.6 大黄-3汤对HMC异常增殖的影响为筛选诱导剂TGF-β1有效促进HMC异常增殖的最佳浓度，我们在研究中选用0、0.1、0.5、1、2、4、5和10 mg·L-1浓度的TGF-β1诱导HMCs增殖，CCK-8检测结果显示0.5、1、2、4、5和10 mg·L-1浓度的TGF-β1均可明显促进HMC增殖(P<0.05)。为保证有效且经济的前提下，在此浓度中我们选用1、2、5和10 mg·L-1浓度的TGF-β1作为有效诱导浓度来诱导HMC增殖。由TGF-β1诱导的同时用不同时间点的大黄-3汤含药血清给予治疗。CCK-8检测结果显示，与正常组大鼠血清相比，大黄-3汤给药5 d、末次给药后2 h的血清能明显抑制1、2 mg·L-1TGF-β1诱导的HMC增殖；对5、10 mg·L-1TGF-β1诱导的增殖无抑制作用(Fig 4A，B)。

3.7 大黄-3汤对HK-2表型转化的影响选用0、0.1、1、2、5和10 mg·L-1浓度的TGF-β1诱导肾HK-2间质转化，结果1 mg·L-1的TGF-β1被选为最佳诱导HK-2间质转化的浓度(Fig 4C,D)。由1 mg·L-1的TGF-β1诱导HK-2的同时用正常和大黄-3汤给药7 d的含药血清治疗，结果表明，与正常组相比，大黄-3汤给药7 d，末次给药后1 h和3 h的含药血清能显著升高HK-2标志物CK18的表达(P<0.01)(Fig 4E,F)；末次给药后3 h的含药血清能显著降低间质成纤维标志物Vimentin的表达(P<0.05)(Fig 4G)。

3.8 大黄-3汤对CRF模型大鼠肾纤维化相关基因的影响与正常组相比，模型组CK18 mRNA表达显著降低(P<0.01)；TGF-β1、Vimentin、FN mRNA表达明显升高(P<0.05)。大黄-3汤中、高剂量治疗后CK18 mRNA表达明显升高(P<0.05)；大黄-3汤低、中、高剂量能显著降低TGF-β1mRNA表达(P<0.01)；大黄-3汤高剂量能显著降低Vimentin mRNA表达(P<0.01)；大黄-3汤高剂量能显著降低FN mRNA表达(P<0.01)(Fig 5A)。以上结果表明大黄-3汤能改善CRF模型大鼠肾纤维化相关基因异常表达。

3.9 大黄-3汤对CRF模型大鼠肾纤维化及TGF-β/Smad通路相关蛋白的影响与正常组相比，模型组α-SMA、Smad 2、Smad 3、PCNA蛋白表达明显增加(P<0.05)；E-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.05)。大黄-3汤低、中、高剂量治疗能明显降低α-SMA蛋白表达(P<0.01)；大黄-3汤低、中剂量能明显升高E-cadherin蛋白表达(P<0.01)；大黄-3汤低、高剂量能明显降低Smad2、Smad3蛋白表达(P<0.01)；大黄-3汤中剂量能明显降低PCNA蛋白表达(P<0.01)(Fig 5B-C)。以上结果表明，大黄-3汤能明显改善CRF模型大鼠肾纤维化导致的TGF-β/Smad通路相关蛋白异常表达。

Fig 5 Effect of rhubarb-3 decoction on expression of fibrosis related genes and proteins in renal tissues of CRF rats(A) The effect of rhubarb-3 decoction on the expression of CK18, TGF-β1, vimentin and FN mRNA in CRF rats. (B)Western blot strip graph. (C) The effect of rhubarb-3 decoction on the expression of α-SMA, Smad 2, Smad 3, PCNA and E-cadherin protein in CRF rats. #P<0.05, ##P<0.01 vs normal group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group.

4 讨论

肾纤维化是肾功能丧失的主要原因，并被认为是导致终末期肾病的关键病理特征。肾纤维化的主要特征包括肾间质转化和肾小球硬化。肾脏固有细胞-肾小球系膜细胞异常增殖和肾小管上皮细胞间质成转化(EMT)在肾纤维过程中起着重要作用[11]。而且TGF-β是肾纤维化的关键驱动因素，参与导致慢性肾病和终末期肾病(ESRD)的动态病理生理过程[12]。最近的证据表明TGF-β/Smad信号通过表观遗传相关机制调节肾纤维化。在病理条件下，肾小球系膜细胞被激活，导致过度增殖和过量的细胞外基质[13]和肾小管上皮细胞细胞间质转化成成纤维细胞[14]。系膜细胞过度增殖导致的细胞数量增加和促纤维化标志物基因表达增强诱导的细胞外基质积聚最终导致肾小球纤维化。因此，维持系膜细胞功能和逆转异常基因表达有利于正常肾功能。上皮间质转化(EMT)是肾间质纤维化进程中的重要信号通路，其代表上皮细胞及其黏附分子(包括E-cadherin)的损失，以及间充质细胞和标记物(如α-SMA)的增加。TGF-β是肾纤维化的关键驱动因素，通过各种细胞因子诱导α-SMA的表达来促进肌成纤维细胞发育的重要介质。在肾纤维化过程中，下游Smad信号通路被TGF-β1激活，导致肾瘢痕形成。因此，操纵下游TGF-β1信号传导是逆转上皮间质转化和肾间质纤维化的有效治疗靶点，而且有研究表明TGF-β1/Smad信号通过表观遗传相关机制调节肾纤维化[15]。

在蒙医基础和临床上，蒙药大黄-3汤多数用于口服给药，外用药时一般用于蒙医尼如哈( 类似中药灌肠)[16]。大黄-3汤其成分中大黄具有下泄，清热解毒，助消化之功效；碱面具有防止大便干燥之功效；诃子具有解毒之功效。大黄含有多种生物活性成分，其中大黄素、大黄鞣质、乐丹宁、大黄酸蒽醌葡萄糖苷及大黄蒽醌是目前被认为对CRF起治疗作用的主要成分[17]。现代药理研究表明大黄主要通过对氮质代谢、免疫能力、脂质代谢及自由基、参与肾脏代偿性肥大、肾小球系膜细胞功能的影响发挥作用能延缓CRF[18]。

肾脏是排泄许多水溶性、非挥发性药物及其代谢物的重要器官。肾脏疾病能改变药代动力学过程，如(1)减慢药物消除速，延长半衰期；(2)改变药物代谢的速度或途径；(3)减少药物与血浆蛋白结合，增加血浆游离型药物的浓度；(4)改变分布容积等。这些改变常常导致药物作用的增强以及不良反应的增加。为避免不良反应的发生，肾病时给药法必须进行调整，或减少药量，或延长给药间隔时间。本研究在造模成功后连续给药治疗6周，停药19周，再连续给药6周，共治疗31周。本研究结果表明，大黄-3汤能明显降低Scr和BUN水平、抑制肾小球系膜细胞异常增殖和肾小管上皮细胞间质转化并明显改善CRF大鼠肾组织PCNA、α-SMA、E-cadherin、Smad2、Smad3蛋白及CK18、Vimentin、TGF-β1、FN mRNA表达。提示大黄-3汤可能其抑制系膜细胞异常增殖、肾小管间质纤维化、延缓慢性肾衰进展可能与抑制 TGF-β1/Smad信号通过激活有关。