李颖利，卞 博，刘东娇，赵晨光，郝元森，韩 立，卞 华，郭克磊

(南阳理工学院 1.张仲景国医国药学院、2.河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南 南阳 473004)

系统性硬化病(systemic sclerosis，SSc)是一种以皮肤增厚和纤维化及胃肠道、肺、心、血管等多个系统受累为特征的自身免疫性疾病。SSc的病因及发病机制十分复杂，目前认为病因与遗传和环境因素有关，发病机制包括血管病变、免疫系统功能失调、纤维化及3者间的相互作用，共同导致了SSc的发生和发展[1]。毛细血管和小动脉等微血管的损伤和内皮细胞的活化导致的血管病变是SSc进程中最早出现的病变[2]。近年研究发现，Sema3A/Nrp1途径的异常调节与血管病变过程密切相关，Sema3A/Nrp1轴已成为血管病变相关疾病的治疗靶点。

中医药治疗SSc有较好效果，药理研究机制以抗纤维化为主[3]。本课题组基于肺脾肾-皮毛相关理论指导创立温阳化浊通络方治疗SSc具有较好临床疗效，前期研究发现温阳化浊通络方能够降低SSc患者血浆内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)水平、循环内皮细胞数量，降低SSc患者甲襞血管管攀形态、血管流态、襻周状态的积分；温阳化浊通络方还可抑制SSc模型小鼠血清VEGF、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)和ET-1的表达水平[4-6]。说明温阳化浊通络方具有保护血管，改善甲襞微循环障碍的作用，但其机制还不清楚。本研究通过建立SSc小鼠模型，观察温阳化浊通络方对SSc小鼠Sema3A/Nrp1信号通路的影响，探讨其治疗SSc的作用机制，为SSc的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级C57BL/6N♀小鼠60只，体质量(18～20) g，7～8周龄，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK(浙)2019-0001，所有动物的饲养及实验操作均符合实验动物福利及伦理要求。

1.2 药物注射用盐酸博来霉素(批号19033911，1.5万U)购自瀚晖制药有限公司；Sema3A抑制剂EGCG(纯度99.87%，HY-13653)购自美国MedChemExpress；温阳化浊通络组方药材黄芪30 g、党参15 g、桂枝9 g、淫羊藿12 g、积雪草15 g、白芥子9 g等购自河南省张仲景大药房。温阳化浊通络组方药液制备方法如下：将所有组方药材混合用蒸馏水浸泡30 min，置于陶瓷中药煎锅内武火煎煮开后煎30 min，过滤并收集药液，再次加入蒸馏水煎30 min，合并两次滤液浓缩至药液浓度相当于生药2.8 kg·L-1，于-20 ℃ 冰箱保存备用。依据人和小鼠每公斤体重剂量折算系数计算，温阳化浊通络方低、中、高剂量组的给药剂量分别为21、42、84 g·kg-1。

1.3 主要试剂与仪器4%多聚甲醛固定液(P0099)、苏木精伊红(HE)染色试剂盒(C0105S)、DAB显色试剂盒(P0203，上海碧云天)；BCA蛋白测定试剂盒(A53226)、ECL化学发光试剂盒(34577，美国Thermo Fisher)哺乳动物蛋白抽提试剂盒(CW0889，北京康为世纪)；GAPDH鼠单抗(AC002，武汉爱博泰克)，Sema3A兔多抗(DF8609)、VEGFA兔多抗(AF5131，江苏亲科)，Nrp1鼠单抗(sc-5307，美国Santa Cruz)，HRP标记羊抗兔二抗(5220-0336)、羊抗鼠二抗(074-1806，美国KPL)；小鼠Sema3A ELISA试剂盒(CSB-EL020980MO，武汉华美生物)；石蜡切片机(CUT6062，德国SLEE)，包埋机(TKY-BMB，湖北泰康医疗)，组织脱水机(MTM，德国SLEE)，倒置显微镜(IX71，日本OLYMPUS)，组织细胞破碎仪(Bullet Blender STORM，美国Next Advance)，全功能酶标仪(Synergy H1，美国BioTek)，蛋白电泳仪(Mini-PROTEAN 3)、凝胶成像系统(Gel Doc XR+，美国Bio-Rad)。

1.4 模型构建及实验分组将60只小鼠随机分为对照组(Control)、模型组(SSc model)、Sema3A抑制剂组(EGCG)、温阳化浊通络方低(Low dose)、中(Medium dose)、高(High dose)剂量组，每组各10只。对照组连续皮下注射4周PBS 0.1 mL·d-1，其余各组给予200 mg·L-1的博莱霉素(用pH 7. 4的PBS稀释) 0.1 ml·d-1皮下注射连续4周，建立SSc模型[7]。

1.5 给药方法对照组和模型组小鼠给予生理盐水0.3 mL·d-1灌胃连续4周；Sema3A抑制剂组采用腹腔皮下注射10 mg·kg-1·3d-1，连续注射4周；温阳化浊通络方低、中、高剂量组灌胃剂量分别为21、42、84 g·kg-1·d-1，连续给药4周。

1.6 皮肤组织病理学检测取背部造模部位皮肤，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、脱水，HE染色，封片，光学显微镜下观察皮肤病理改变。每组内每张切片随机挑选3个100倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件以100倍标尺为标准，选取合适的视野，每张切片测量5处皮肤真皮层厚度(μm)，并求出平均值。

1.7 免疫组化法检测皮肤组织VEGFA表达将4%多聚甲醛固定的小鼠皮肤取出进行蜡块包埋、切片置载玻片，脱蜡至水，EDTA进行抗原修复，3% BSA室温孵育30 min，滴加VEGFA(1 ∶100)一抗，洗涤，加二抗(1 ∶200)，洗涤后DAB显色封片于显微镜下观察拍摄。每组内每张切片随机挑选3个200倍视野进行拍照，应用Image-Pro Plus 6.0软件分析阳性的累积光密度值(IOD)以及组织的像素面积(AREA)，并求出平均光密度值IOD/AREA(Mean Density)。

1.8 Western blot法检测皮肤组织Sema3A、Nrp1及VEGFA蛋白表达给药4周后，取小鼠背部皮肤，加入哺乳动物蛋白抽提试剂进行组织匀浆，冰浴裂解，离心后取上清液，BCA蛋白定量试剂盒定量上清中蛋白浓度，取30 μg待测蛋白加入上样缓冲液，煮沸10 min；SDS-PAGE电泳后转至硝酸纤维素膜，5% BSA封闭1 h，加入Sema3A、Nrp1、VEGFA一抗孵育2 h，TBST洗涤5次，加入对应HRP标记兔、鼠二抗孵育2 h，TBST洗涤5次，ECL试剂显影后使用凝胶成像分析系统拍照，ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.9 ELISA法检测血清Sema3A水平末次灌胃后半小时，麻醉小鼠通过眼眶动脉采血，收集血液放入不含抗凝剂的试管中，4 ℃静置2～3 h，以2 500 r·min-1离心10 min，取上层血清，按照ELISA试剂盒操作步骤检测各组血清中Sema3A的水平。

2 结果

2.1 HE染色检测各组小鼠皮肤组织病理变化Fig 1结果显示，与对照组比较，SSc模型组真皮层可见炎性细胞浸润，毛囊、汗腺等结构减少，血管壁增厚，局部可见成纤维细胞增生，炎性细胞浸润；与模型组比较，温阳化浊通络方低、中、高剂量组和抑制剂组小鼠真皮层炎性细胞浸润减少。如Fig 2所示，与对照组相比，模型组真皮层明显增厚(P<0.01)；与模型组相比，EGCG组真皮厚度明显减弱(P<0.01)，低、中、高剂量温阳化浊通络方处理后真皮层厚度均变薄(P<0.05)。

Fig 1 HE staining of mouse skin tissues (×100)

Fig 2 Effect of WYHZTLF on dermal thickness n=5)1:Control;2:SSc model;3:Low dose;4:Medium dose;5:High dose;6:EGCG. △△P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs SSc model

2.2 免疫组化法检测各组小鼠皮肤组织VEGFA蛋白表达如Fig 3、4所示，与对照组比较，SSc模型组VEGFA蛋白表达增加(P<0.05)；与模型组比较，EGCG组VEGFA蛋白表达明显降低(P<0.05)，温阳化浊通络方低、中、高剂量组VEGFA蛋白表达均降低，中、高剂量组差异具有显著性(P<0.05)。

Fig 3 Immunohistochemistry of VEGFA in mouse skin tissues (×200)

Fig 4 Effect of WYHZTLF on VEGFA protein 1:Control;2:SSc model;3:Low dose;4:Medium dose;5:High dose;6:EGCG. △P<0.05 vs Control; *P<0.05 vs SSc model

2.3 Western blot检测小鼠皮肤Sema3A、Nrp1及VEGFA蛋白表达结果如Fig 5所示，与对照组比较，SSc模型组Sema3A、VEGF蛋白表达明显增加(P<0.05，P<0.01)，Nrp1蛋白表达明显减弱(P<0.01)；与模型组相比，温阳化浊通络方低、中、高剂量组Sema3A、VEGFA蛋白表达均降低，差异具有显著性(P<0.05，P<0.01)，Nrp1蛋白表达均增强，高剂量组差异具有显著性(P<0.05)，EGCG组Sema3A表达降低(P<0.05)，VEGFA表达显著降低(P<0.01)，Nrp1蛋白表达明显增强(P<0.05)。

Fig 5 Effect of WYHZTLF on Sema3A, Nrp1 and VEGFA protein expression n=5)A: Western blot results for Sema3A、Nrp1 and VEGFA. B, C, D;The relative protein expressions levels of Sema3A, Nrp1 and VEGF A. 1:Control;2:SSc model;3:Low dose;4:Medium dose;5:High dose;6:EGCG. △P<0.05，△△P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs SSc model

2.4 ELISA检测血清Sema3A表达水平结果如Fig 6所示，与对照组相比，SSc模型组血清Sema3A水平明显增加(P<0.01)；与模型组相比，温阳化浊通络方低、中、高剂量组血清Sema3A水平均降低，差异具有显著性(P<0.01)，EGCG组血清Sema3A水平显著降低(P<0.01)。

Fig 6 Mouse serum levels of Sema3A determined 1:Control;2:SSc model;3:Low dose;4:Medium dose;5:High dose;6:EGCG.△△P<0.01 vs Control; *P<0.05,**P<0.01 vs SSc model

3 讨论

信号素家族蛋白Sema3A及其受体Nrp1在免疫调节、细胞凋亡、细胞迁移和血管生成等过程中发挥关键作用，以Sema3A/Nrp1为靶点的针对自身免疫性疾病的治疗已成为当今研究的热点[8]。Sema3A是分泌性的糖蛋白，其发挥功能必须与受体Nrp1结合才能协同胞内信号转导。Nrp1在脊椎动物中结构高度保守，其主要表达于动脉内皮细胞，Nrp1的胞外段不同结构域可分别与Sema3A或VEGFA结合介导信号传导[9]。

Sema3A及其受体Nrp1相互作用通路的改变，参与了SSc患者血管系统的重塑。研究发现SSc患者血清Sema3A水平较正常人高表达，可能参与新生血管生成机制的调节导致SSc血管生成的紊乱[10]。同时，研究发现SSc患者血清和皮肤Nrp1的表达水平显著降低，并且较低水平的循环Nrp1与NVC异常的严重程度和指(趾)端溃疡的存在有关，而血管内皮细胞沉默Nrp1基因及用SSc患者血清处理的血管内皮细胞都能够导致血管生成受损，结果表明Nrp1缺陷在SSc血管生成中发挥关键作用[11]。本研究通过建立SSc小鼠模型，发现模型小鼠皮肤组织Sema3A蛋白上调表达，Nrp1蛋白下调表达，提示Sema3A/Nrp1信号轴可能参与了SSc疾病进程，这与上述研究结果相一致；给与温阳化浊通络方治疗后，Sema3A蛋白下调表达，Nrp1蛋白上调表达，提示温阳化浊通络方可能通过调节Sema3A/ Nrp1改善SSc血管生成紊乱。然而也有研究显示Sema3A在SSc患者血清中表达较正常人低，此外，血清Sema3A低表达水平与疾病持续时间及SCL-70抗体阳性负相关[12]。这与前述文献结果不一致，Sema3A水平在SSc患者中差异表达，可能与分析的患者数量少或患者处于不同的疾病分期等原因有关，与本文结果不一致，可能是因为SSc小鼠模型与SSc患者之间的差异造成的，Sema3A在SSc中的表达及作用机制还需大量临床病例数据及实验去进一步证实。

VEGF是调节血管生成的一个重要因子，其通过参与血管新生及血管形成、维护血管正常状态及完整性等生物过程在SSc进程中发挥作用[13]。研究表明,SSc患者真皮和表皮中VEGFA的表达水平显著增加，不同疾病阶段的血清中VEGF也显著上调表达，但病史时间长的患者体内血管数量却是减少的，尤其是小血管的数目，高水平VEGFA的持续刺激可引起血管生成异常及炎症反应的发生[14]。而VEGFA需要通过与Sema3A受体Nrp1和酪氨酸激酶受体VEGFR-1、VEGFR-2结合才能够发挥其生物学功能，但这两者在SSc患者皮肤的内皮细胞中均上调表达[15]。同时，Sema3A与VEGF165之间存在竞争性结合Nrp1，高浓度的Sema3A可竞争性结合Nrp1，在内皮细胞中减少Nrp1与VEGF165的结合，从而抑制血管内皮细胞的黏附，进而抑制血管增生[16]。本研究免疫组化及WB结果显示，VEGFA在SSc模型小鼠皮肤组织及微血管内上调表达，温阳化浊通络方治疗后，VEGFA下调表达，提示温阳化浊通络方可能通过下调VEGFA的表达调节SSc血管生成异常。

综上所述，VEGFA及Sema3A/Nrp1途径的异常调节与SSc血管病变过程密切相关，温阳化浊通络方可通过下调Sema3A、VEGFA表达，上调Nrp1表达改善SSc血管病变。但血管生成调节过程异常复杂，温阳化浊通络方通过Sema3A/Nrp1调节SSc血管生成的详细机制及其是否还通过调节其它信号通路发挥治疗SSc的作用是本课题组有待深入研究的方向。