余 伟，黄长山，丁月超，黄 涛，马 超，张 锴，王 谦

(郑州大学附属肿瘤医院肝胆胰外科，河南 郑州 450008)

肝缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是肝脏手术或肝移植的必要组成部分，在缺血过程中不可避免地会导致肝损伤，再灌注后肝功能也不太可能迅速恢复正常，且还会增加肝损伤[1]。在大多数情况下，肝脏手术后会出现炎症和损伤，甚至严重的肝功能障碍；严重的肝I/R损伤还可能导致多器官衰竭甚至死亡[2]。因此，探索能减轻肝I/R损伤的策略对改善患者预后和降低死亡率具有重要意义。

肝I/R损伤涉及复杂的生理过程，如代谢紊乱、氧化应激和炎症反应等[3]。香叶木素[diosmetin，Dio，5,7-二羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-4-苯并吡喃酮，C16H12O6]是一种具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种活性的黄酮类化合物。Dio已被报道可减轻心脏、肾脏和其他脏器的I/R损伤[4-6]，且在脂多糖、对乙酰氨基酚等诱导的肝损伤小鼠模型中其能发挥肝保护作用[7-8]。据此推测Dio可能也具有抗肝I/R损伤的功能。而，Dio对肝I/R损伤的作用和机制仍不完全清楚。因此，本研究观察Dio是否对肝I/R损伤发挥有益作用并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂香叶木素(Dio；货号：465944，北京百灵威科技有限公司)；小鼠白细胞介素(interleukin，IL)-1β(货号：3748)、IL-6(货号：4355)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)(货号：10257)和乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)(货号：12240)ELISA检测试剂盒(均为江苏酶免实业有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(货号：A003-1-2)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)测定试剂盒(货号：E004-1-1)、还原性谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)测定试剂盒(货号：A006-2-1)和总胆红素(total bilirubin，TBIL)测定试剂盒(货号：C019-1-1)(均为南京建成生物工程研究所)；改良Lowry法蛋白定量试剂盒(货号：BTN101102)、RIPA裂解液(货号：BTN131007)、苏木精伊红(Hematoxylin-eosin，HE)试剂盒(货号：YT165)和辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-Streptavidin；货号：YT371)(均为北京百奥莱博科技有限公司)；SP免疫组织化学试剂盒(货号：SP0041)和West Pico ECL超敏发光液(货号：PE0020)(北京索莱宝生物技术有限公司)；IL-1β抗体(货号：WLH3903)、caspase-3抗体(货号：WL04004)、cleaved-caspase-3抗体(货号：WL01992)、p38抗体(货号：WL00764)、p-p38抗体(货号：WL03428)和HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(货号：WLA023)(均为万类生物科技有限公司)；核因子(nuclear factor，NF)-κB p65抗体(货号：8242)和p-NF-κB p65抗体(货号：3033)(美国CST公司)；GAPDH抗体(货号：BA2913)(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 实验动物♂ SPF级C57BL/6J小鼠(6-7周，19～22 g)购自河南省实验动物中心(动物生产许可证号：SCXK(豫)2017-0001)。小鼠被安置在郑州大学实验动物中心屏障环境动物房[每笼不超过5只小鼠，21 ℃～23 ℃，55%～65%湿度，12 h光照/黑暗周期，动物使用许可证号：SYXK(豫)2020-0008]。所有动物实验均按照中国动物保健和使用委员会的指南进行，并经郑州大学伦理委员会机构动物保健和使用委员会批准(批准号：2019-564)。

1.3 仪器显微镜(IX53；日本Olympus公司)；酶标分析仪(DNM-9606；北京普朗新技术有限公司)；荧光酶标仪(SpectraMax Gemini EM；美国Molecular Devices公司)；全自动蛋白印迹处理系统(WB-600Auto；广州博鹭腾生物科技有限公司)；eBlot接触式化学发光成像系统(eBlot Touch Imager；上海易孛特光电技术有限公司)。

1.4 方法

1.4.1小鼠肝I/R损伤模型及实验设计 适应性饲养3 d后，将32只小鼠按照随机数字法分为假手术(Sham)组、I/R组、低剂量Dio组和高剂量Dio组，每组8只。I/R组按照Yang等[9]的方法，用异氟醚麻醉后，解剖腹部并用一个创伤性夹穿过门静脉三联体阻断70%肝动脉/门静脉血液，并于缺血1 h后，取出夹子行再灌注。Sham组除不进行肝I/R手术外，其余手术步骤同I/R组。低和高剂量Dio组行肝I/R手术前30 min分别通过腹腔注射10 mg·kg-1和40 mg·kg-1Dio，Sham组和I/R组通过腹腔注射等体积的含2% DMSO的生理盐水。再灌注后24 h，用异氟醚麻醉小鼠，采集各组小鼠的血液和肝脏样本。

1.4.2HE染色与组织学分析 肝组织样品在4%多聚甲醛中固定48 h后，并用石蜡包埋。石蜡包埋的肝组织切为5 μm厚的连续石蜡切片后，依次经脱蜡、水合后，用HE染色。两名研究人员按照Yang等[9]的方法使用光学显微镜以盲法评估组织学情况。

1.4.3ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、LDH和AST的水平 根据制造商的说明，分别采用对应的试剂盒进行ELISA反应，用酶标仪在450 nm处读取样品的吸光度值，并根据各自的标准曲线计算血清中IL-1β、IL-6、LDH和AST的水平。

1.4.4试剂盒法检测肝组织中氧化应激指标和TBIL的水平 将肝组织用冰PBS按照1 ∶9进行匀浆，3 600×g离心收集肝组织匀浆液。用改良Lowry法蛋白定量试剂盒测定肝组织匀浆液中蛋白含量。根据制造商的说明，用硫代巴比妥酸法(酶标仪在波长530 nm处读取样品的吸光度值)测量肝组织匀浆液中MDA含量，用化学荧光法(荧光酶标仪在发射波长530 nm处读取样品的荧光度值)测量肝组织匀浆液中ROS含量，用二硫代二硝基苯甲酸法(酶标仪在波长405 nm处读取样品的吸光度值)测量肝组织匀浆液中GSH含量，用亚硝酸钠氧化法(酶标仪在波长450 nm处读取样品的吸光度值)测量肝组织匀浆液中TBIL含量。肝组织中上述氧化应激指标水平=肝组织匀浆液中上述氧化应激指标含量/肝组织匀浆液中蛋白含量。

1.4.5免疫组织化学染色观察肝组织中IL-1β的表达 取肝组织切片(5 μm厚)，常规脱蜡、水合、阻断内源性过氧化氢酶和封闭后，按照常规SP法程序依次孵育IL-1β抗体(1 ∶250稀释)、Bio-山羊抗兔IgG(1 ∶200稀释)和HRP-Streptavidin(1 ∶200稀释)后，用DAB显色，苏木精复染，在显微镜下观察染色情况。

1.4.6Western blot检测肝组织中cleaved-caspase-3、p-NF-κB p65和p-p38蛋白表达 用RIPA裂解液提取蛋白，用改良Lowry法对蛋白定量后，用全自动蛋白印迹处理系统对上样的蛋白进行电泳、电转、封闭和抗体孵育。其中，caspase-3、NF-κB p65、p38和GAPDH抗体的稀释比例均为1 ∶5 000，cleaved-caspase-3、p-NF-κB p65、p-p38和HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)的稀释比例均为1 ∶1 000。用West Pico ECL超敏发光液和eBlot接触式化学发光成像系统对蛋白进行显像并分析相对表达水平。

2 结果

2.1 Dio预处理减轻肝I/R损伤HE染色(Fig 1A)显示，Sham组肝组织基本正常，I/R组肝组织出现大面积坏死和炎性细胞浸润；低、高剂量Dio组由肝I/R诱导的病理改变得到明显缓解。H&E染色量化数据(Fig 1B和1C)显示，与Sham组相比，I/R组肝组织坏死面积和组织学评分均明显增加(P<0.01)；施用Dio预处理明显减小了肝I/R后的坏死面积和肝损伤评分(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组效果更为明显。ELISA结果(Fig 1D和1E)显示，肝I/R后血清LDH和AST水平明显升高(P<0.01)，施用Dio预处理能明显降低肝I/R诱导的血清LDH和AST水平(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组效果更为明显。同时，Western blot结果(Fig 1F和1G)显示，肝I/R后肝组织中cleaved-caspase-3表达水平明显升高(P<0.01)，施用Dio预处理能明显降低肝I/R诱导的肝组织中cleaved-caspase-3表达(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组效果更为明显。

Fig 1 Effect of Dio pretreatment on liver injury after liver I/RA: Representative images of H&E staining (scale bar=50 μm); B: Statistical results of necrotic area; C: Statistical results of liver histological score; D: The level of LDH in serum; E: The level of AST in the serum; F and G: cleaved-caspase-3 expression in liver tissues was detected by Western blot n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

2.2 Dio预处理改善肝I/R后的肝功能并降低氧化应激和促炎因子水平氧化应激指标结果(Fig 2A-2C)显示，与Sham组相比，I/R组肝组织中MDA和ROS水平明显增加(P<0.01)，GSH水平明显降低(P<0.01)；与I/R组相比，低、高剂量Dio组肝肝组织中MDA和ROS水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，GSH水平明显增加(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组变化更为明显；说明Dio预处理能抑制肝I/R诱导的氧化应激。TBIL检测结果(Fig 2D)显示，低、高剂量Dio预处理均能部分逆转肝I/R导致肝组织中TBIL水平增加(P<0.05或P<0.01)，提示Dio预处理改善肝I/R后的肝功能受损。同时，促炎因子检测结果(Fig 3)显示，低、高剂量Dio预处理均能部分逆转肝I/R导致肝组织和血清中IL-1β水平以及血清中IL-6水平升高，Dio预处理减轻肝I/R后的肝部炎症。

Fig 2 Effect of Dio pretreatment on oxidative stressand liver function after liver I/RA:The level of MDA in the liver; B: The level of ROS in the liver; C: The level of GSH in the liver; D: The level of TBIL in the liver n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05,**P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

Fig 3 Effect of Dio pretreatment on inflammatory factors after liver I/RA: The expression and distribution of IL-1β in liver (scale bar=50 μm); B: The level of IL-1β in serum; C: The level of IL-6 in serum n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

2.3 Dio预处理对NF-κB及p38通路的影响Western blot结果(Fig 4)显示，与Sham组相比，I/R组肝组织中NF-κB p65和p38的磷酸化水平明显增加(P<0.01)；与I/R组相比，低、高剂量Dio组肝肝组织中NF-κB p65和p38的磷酸化水平明显降低(P<0.01)，且高剂量组变化更为明显；说明Dio预处理能抑制肝I/R诱导的NF-κB和p38的活化。

Fig 4 Effect of Dio pretreatment on activation of NF-κB and p38 after liver I/RA: Western blot electrophoretogram of NF-κB p65, p-NF-κB p65, p38, and p-p38 protein expression in liver tissue; B: Relative expression level of p-NF-κB p65/NF-κB p65; C: Relative expression level of p-NF-κB p65/NF-κB p65 n=8); #P<0.05 vs Sham group; **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

3 讨论

肝I/R损伤对肝脏手术或肝移植患者的预后有严重的不良影响[2]，而目前并没有很好的预防或治疗办法。本研究以小鼠肝I/R模型探讨了Dio预处理对I/R后肝损伤的影响，结果表明，Dio预处理可降低I/R后的肝损伤，提示，Dio是潜在的对抗I/R后肝损伤的防护剂。

氧化应激在肝I/R损伤的整个病理生理过程发挥重要作用。在肝I/R过程中，ROS的大量积聚是I/R后导致肝损伤的启动和发展的重要因素[10]，同时如SOD和GSH等抗氧化酶耗竭并导致清除氧自由基的能力降低[10-11]，造成肝组织氧化损伤。脂质过氧化物终产物MDA可在一定程度上反映组织氧化损伤程度[10-11]。本研究显示，Dio预处理能降低肝I/R小鼠肝组织中ROS和MDA水平，并能增加清除氧自由基的能力(GSH水平增加)，从而减轻氧化应激。氧化应激也可启动肝I/R后的炎症和细胞凋亡等现象。炎症参与肝I/R损伤的整个病理生理过程，其中，炎症因子的相互作用导致肝脏中炎性细胞的募集和浸润，加剧了炎症级联反应[12]。已有研究表明，IL-1β和IL-6的上调可通过加重炎症反应直接导致肝损伤[13-14]。本研究证实了Dio预处理能降低肝I/R小鼠的IL-1β和IL-6水平，并降低了肝损伤指标LDH、AST和TBIL以及改善肝脏组织学形态表现。此外，凋亡是I/R损伤过程中的一种常见现象，据报道，在肝I/R期间，约50%～70%的内皮细胞和40%～60%的肝细胞经历了凋亡[15]。因此，有效阻断细胞凋亡是减轻肝损伤和维持肝功能的重要途径之一。本研究观察到Dio预处理明显降低了肝I/R小鼠肝组织中cleaved-caspase-3的表达，提示，Dio预处理能降低I/R后肝组织中细胞凋亡。

本研究进一步对Dio预处理发挥肝I/R后的肝保护的作用机制进行了探索。众所周知，肝I/R损伤进程中，NF-κB活化后，启动促炎细胞因子的产生和细胞凋亡，抑制NF-κB活化可减轻肝I/R损伤[16-17]。本研究也观察到肝I/R可上调p-NF-κB p65的表达，相反，Dio预处理可明显降低其表达；说明Dio预处理可减弱肝I/R后肝组织中NF-κB活化。此外，p38激活与白细胞募集和激活的启动有关，其并能进一步导致细胞损伤[18]。本项研究的结果表明，Dio预处理能抑制肝I/R后肝组织中p38的磷酸化。

总之，本结果显示Dio预处理可减轻肝I/R损伤，且这一作用可能与减弱NF-κB和p38活化以及氧化应激有关。并且，本实验还提示了，Dio可能是一种潜在用于抗肝I/R损伤的肝防护剂。