高子晴 崔彤霞

Klotho是近年发现的一种与衰老相关的蛋白，其主要在肾小管上皮细胞中表达。研究发现，不同原因引起的慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）均可导致Klotho表达下调，Klotho缺乏是CKD的早期表现，同时也加速CKD的进展[1]。现已证实甲状旁腺激素（Parathyroid hormone，PTH）是慢性肾脏病患者体内的重要毒素之一，可引起软组织及心血管钙化等全身多系统损害，而Klotho可抑制AngⅡ的激活，减缓CKD的进程[2]，并可以增加血磷的排泄，进一步减少PTH的生成[3，4]。Strutz等[5]首次提出肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肾脏纤维化的重要因素之一，标志着CKD的结局，表现为上皮细胞在转分化的过程中失去上皮细胞标志物（如E-cadherin），获得间充质细胞标志物（如α-SMA）的高表达。近年研究证实，Rho/Rock信号通路是导致CKD肾脏纤维化的重要信号通路之一[6]。法舒地尔（Fasudil）是体内或体外实验使用最为普遍的Rho/Rock信号通路抑制剂，为研究用法舒地尔抑制或减轻PTH诱导的CKD提供了理论依据[7]，但是否可以通过提高Klotho的表达来减轻PTH引起的EMT尚未见报道。本研究拟观察不同浓度法舒地尔对PTH诱导的人肾小管上皮细胞EMT中Klotho表达的影响，以探讨Klotho及法舒地尔在慢性肾脏病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肾小管上皮细胞HK-2（美国ATCC，CRL-2190TM）；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素（美国Gibco）；上皮细胞生长因子（美国Peprotech）；法舒地尔注射液（天津红日药业股份有限公司，规格30mg/2ml）；PTH 1-34（美国Sigma）；α-SMA抗体、E-cadherin抗体、Klotho抗体（美国Santa），PBS溶液（美国Gibco），定量PCR试剂盒（瑞士Roche），Total RNA提取试剂（美国Invitrogen Life Technologies），BCA蛋白定量检测试剂盒（美国Bio-rad）；Actin（美国CST）。

1.2 实验分组 原代肾小管上皮细胞在上皮细胞培养基（胎牛血清10ml，上皮细胞生长因子1ml，青霉素/链霉素1ml，加入88ml基础培养基中）培养下传代，取第3代上皮细胞用于实验，实验分为5组，分别为：空白对照组（C组）：肾小管上皮细胞不作任何处理；T1组：PTH（10-10mol/L）+法舒地尔（0μmol/L）；T2组：PTH（10-10mol/L）+法舒地尔（10μmol/L）；T3组：PTH（10-10mol/L）+法舒地尔（20μmol/L）；T4组：PTH（10-10mol/L）+法舒地尔（30μmol/L）。培养时间为48h。

1.3 实验方法

1.3.1 Western-blot检测Klotho蛋白的表达 培养48h后，用TBS缓冲盐水冲洗肾小管上皮细胞3次，在培养皿中加入RIPA裂解缓冲液，通过反复摇动使试剂与细胞充分混合，用细胞刮刀将细胞刮下来并收集。细胞裂解液（30μg）在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，与驴抗鼠抗体（0.2μg/ml）、驴抗兔抗体（0.2μg/ml）作为内部对照进行杂交，然后用1μg/ml抗驴免疫球蛋白G-过氧化物结合物对条带进行扫描测量其强度，使用数字凝胶电泳图像处理和分析系统进行检测。

1.3.2 RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA及Klotho mRNA表达 培养48h后，用Trizol试剂从肾小管上皮细胞分离出总RNA。进行RT-PCR分析，用反转录酶和oligo dT引物从1μg总RNA中合成cDNA，体积为10μl，用Tris/EDTA缓冲液将反应混合物调整为50μl，用于PCR分析。cDNA扩增反应混合物最初在95℃温育30s以使DNA变性；扩增进行40个循环，95℃5s，60℃34s。RTPCR在以下条件下进行，95℃2min，然后进行40个循环，95℃35s，60℃1min，72℃2min，通过熔解曲线分析，用肌动蛋白作为内源性控制基因对数据进行处理。使用引物：E-cadherin：上游5'-CCGGGACAACGTTTATTACTAT-3'，下游5'-CATA GTCAAACACGAGCAGAGAAT-3'；α-SMA：上游5'-CTTGAGAAGAGTTACGAGTTGC-3'，下 游5'-GATGCT GTTGTAGGTGGTTTC-3'；Klotho：上游5'-ACAATACT TCTTTCCGTCCCACT-3'，下游5'-GAGCAAAAAAGTC AGCAGTTCCT-3'；Actin：上游5'-CACCCAGCACAAT GAAGATCAAGAT-3'，下游5'-CCAGTTTTTAAATCCT GAGTCAAGC-3'。根据2-△△Ct方法计算相对表达率。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多个样本均数两两之间比较采用LST-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学改变 倒置显微镜下观察，正常肾小管上皮细胞呈圆形或类圆形，排列如铺路石样，经PTH刺激后不同程度地拉长，变为长梭形或不规则形，胞间连接变松散，排列呈索条状。外源性给予法舒地尔后，上皮细胞发生EMT的细胞数量减少，见图1。

图1 细胞形态学改变

2.2 Western-blot检测结果 T1组在PTH的刺激下Klotho蛋白表达明显减少；而在法舒地尔干预下，T2～T4组Klotho蛋白表达明显增多，并且随着法舒地尔的浓度增高，Klotho蛋白水平逐渐升高，T3组达到峰值，T4组与T3组相比稍有下降，见图2。

图2 各组Klotho蛋白的表达

2.3 RT-PCR检测结果 T1组在PTH刺激下Klotho mRNA表达明显减少。而在法舒地尔的干预下，与T1组相比T2～T4组Klotho mRNA表达明显增强（P<0.05），并且随着法舒地尔的浓度增高，Klotho mRNA表达水平逐渐升高，T3组达到峰值，T4组稍有下降，但与T3组相比差异无统计学意义（P>0.05）。与C组相比，T1～T4组E-cadhernin mRNA表达明显下降，α-SMA mRNA表达明显增加，尤其以T1组最为显著（P<0.05）。在T1～T3组，随着法舒地尔浓度增高，E-cadhernin mRNA表达量逐渐上升，α-SMA mRNA表达量逐渐下降，T3组达到峰值，T4组稍有所下降，但T3、T4组差异无统计学意义（P>0.05），各组与T1组相比差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各组E-cadherin、α-SMA、Klotho mRNA水平比较（±s）

表1 各组E-cadherin、α-SMA、Klotho mRNA水平比较（±s）

注：与T1组比较，*P<0.05；与C组比较，ΔP<0.05

项目 C 组 T1组 T2组 T3组 T4组α-SMA mRNA 0.901±0.015* 2.278±0.116Δ 1.811±0.364*Δ 1.300±0.083*Δ 1.402±0.127*Δ E-cadherin mRNA 1.493±0.011* 0.295±0.007Δ 0.824±0.032*Δ 1.186±0.097*Δ 1.092±0.027*Δ Klotho mRNA 1.207±0.029* 0.362±0.016Δ 0.882±0.101*Δ 1.291±0.091*Δ 1.212±0.038*Δ

3 讨论

肾小管EMT是肾脏成纤维细胞的主要来源，在肾脏纤维化的发生与进展中起着重要作用，其中PTH是促进EMT的重要细胞因子。Klotho蛋白是近年研究发现的一种与衰老相关的蛋白，其主要在肾小管上皮细胞中表达。有研究表明，在肾脏损伤情况下，Klotho蛋白表达下调，而该蛋白表达下调促进了肾脏损伤，导致Klotho蛋白进一步下降，通过提高内源性Klotho蛋白表达或增加外源性Klotho蛋白可缓解及阻止肾脏疾病的发生发展，说明Klotho蛋白不仅是早期肾损伤的标记物，更是保护因子[8，9]。法舒地尔是唯一用于临床的Rho/Rock信号通路选择性抑制剂[10]，可以减少蛋白尿和肾小球系膜外基质堆积，减轻肾小球硬化和肾间质纤维化等[11～13]。基于此，本实验研究Rho/Rock信号通路抑制剂法舒地尔对PTH诱导人肾小管上皮细胞EMT中Klotho蛋白表达的影响，可能有助于寻找防治肾脏纤维化的新靶点。

本研究在倒置显微镜下观察正常肾小管上皮细胞形态，呈圆形或类圆形，排列如铺路石样，不杂乱；而加入PTH后，肾小管上皮细胞呈不同程度的拉长，变为长梭形或不规则形，胞间连接变松散，排列呈索条状，呈典型的纤维样改变。在法舒地尔的干预下，发生形态改变的细胞数量明显减少，EMT明显减轻。说明PTH可以诱导EMT，而外源性给予法舒地尔可明显减轻纤维化程度，减少肾小管上皮细胞损伤，进一步延缓CKD进程。

通过Western-blot和RT-PCR检测Klotho蛋白和mRNA的表达结果显示，T1组在PTH刺激下Klotho mRNA和蛋白表达明显减少，而在法舒地尔的干预下，T2～T4组Klotho mRNA和蛋白表达明显增强，并且随着法舒地尔的浓度增高，Klotho mRNA和蛋白水平逐渐升高，其中法舒地尔在20μmol/L时作用最显著，并且T3、T4组Klotho mRNA表达水平均高于C组，说明在PTH诱导的肾小管上皮细胞EMT过程中，肾小管上皮细胞内源性Klotho表达明显减少，而在Rho/Rock信号通路抑制剂法舒地尔的干预下，肾小管上皮细胞EMT程度减轻，并可同时诱导人肾小管上皮细胞内源性Klotho表达增高，更进一步减轻EMT。随着Klotho的表达增加，上皮细胞标志物E-cadherin表达上调，间充质细胞标志物α-SMA表达下调，标志着EMT程度减轻，也从另一个角度说明在法舒地尔的干预下，上调Klotho的表达可减缓EMT的发生、发展。提示Klotho在肾脏纤维化发生、发展过程中起着重要的保护作用。但是关于Klotho的传导通路、对肾脏的具体保护作用机制及PTH、Rho/Rock信号通路诱导EMT的机制等尚需进一步研究。

综上所述，法舒地尔在PTH诱导的人肾小管上皮细胞EMT中，可能通过上调Klotho表达减缓EMT的发展。