李文凤，李 婕，普家荣，王晓燕，单红丽，张荣跃，普金安，李银煳，黄应昆

（1云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远 661699；2新平县经济作物工作站，云南新平 653400）

0 引言

云南地处低纬高原，在21°8′—29°15′N、97°31′—106°11′E 之间均有甘蔗种植，蔗区气候和环境复杂多变[1]。加之甘蔗属无性繁殖宿根性作物，多年来轮作区域少，长期连作，导致甘蔗病害日趋积累而加重；多种病原复合侵染，扩展蔓延迅速，甘蔗受损极为严重[2-3]。自2015 年以来多雨高湿加上感病品种规模化种植，导致甘蔗中后期灾害性真菌病害在临沧、玉溪、版纳、普洱等低纬高原蔗区流行成灾，减产减糖严重[4-5]。多数蔗区因防治不及时不到位，感病品种常出现大量蔗茎枯死，病株率60%～100%；甘蔗减产30%～48%；糖分降低2%～4%，经济损失巨大[5-6]。因此，如何精准诊断和防控甘蔗中后期灾害性真菌病害成为甘蔗产业高质量发展的重要任务。

甘蔗属喜温作物，大部分蔗区属于热带、亚热带[1]，7—10 月多雨高温高湿，甘蔗梢腐病、褐条病、锈病、叶焦病、褐斑病、黄点病、眼斑病、轮斑病等多种病害极易发生流行、并发为害[2,5]，尤以梢腐病、褐条病、锈病发生普遍、报道较多[5,7-8]。国内外研究表明甘蔗梢腐病菌种类繁多，目前已报道的有7种镰刀菌[9-11]，不同国家和蔗区病菌种群及优势种存在差异[12]，中国已确定的有5 种，优势种为Fusarium verticillioides[13-15]；已报道的甘蔗褐条病菌多为平脐蠕孢属Bipolaris[4,8]；根据症状和病原特征，甘蔗锈病菌有黑顶柄锈菌Puccina.MelanocephalaSyd.et P.Syd、屈恩柄锈菌Puccina.kuehniiButler 和黄褐锈菌Macruropyxis fulvasp.nov 3种[16-17]。目前，国内外关于甘蔗梢腐病的研究多为致病病原分离鉴定、病菌生物学特性及代谢产物测定[18-19]，少数对其发生为害情况、形态与品种抗性评价和防控等作了初步调查分析和探索[20-21]；对甘蔗褐条病的研究报道甚少，多是一些关于该病发生情况和防治上的初步调查研究[4,22-23]；就甘蔗锈病也多是病菌检测鉴定、生物学特性和抗病基因标记开发与检测[24-26]，少数对其发生为害情况、品种抗性和防控进行了初步调查[5,27-28]。

低纬高原云南蔗区是中国第二大甘蔗产区，甘蔗中后期灾害性真菌病害逐年扩展蔓延加重危害，而有关低纬高原甘蔗中后期灾害性真菌病害缺乏系统研究，病原类群与品种抗性不清、为害损失及致灾因子不明，有效防控缺乏基础和科学依据。为此，针对低纬高原甘蔗中后期灾害性真菌病害大面积暴发为害和防控问题，云南省农业科学院甘蔗研究所牵头糖企药企开展科企合作、产学研结合，进行了系统的调查检测与试验研究，以期明确低纬高原甘蔗中后期灾害性真菌病害种类、病原类群、为害损失及灾害特性，为防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查及样品采集

于2015—2020年7—10月发病期，分别对临沧、玉溪、版纳、普洱、红河、保山、德宏、文山等低纬高原蔗区进行调查采样，观察并记录病害症状。

甘蔗梢腐病随机取3点，每点调查100株，记录调查总株数、病株数，计算病株率，见公式(1)。

甘蔗褐条病和甘蔗锈病采用3 点取样，每点调查20 株。参照杨子林等[29]和Comstock 等[30]的标准进行病情分级，其中，1级—叶片无症状；3级—病斑占叶面积0%～25%；5 级—病斑占叶面积26%～50%；7 级—病斑占叶面积51%～75%；9 级—病斑占叶面积76%～100%。

1.2 病原检测鉴定

1.2.1 DNA 提取 取各待测病叶0.2 g，用植物基因组DNA 试剂盒提取DNA，用Eppendorf AG 22331 蛋白/核酸分析仪检测提取DNA质量，-20℃保存备用。

1.2.2 甘蔗梢腐病病原分子检测 采用基于核糖体DNA 非转录间隔区(rDNA-ITS)序列设计的F.verticillioides和F.proliferatum特异性引物，即Fv-F4/Fv-R4和Fp-F3/Fp-R3，委托上海生工生物技术有限公司合成，其序列为：Fv-F4：5'-TCG GGG CCG GCTT GCCGC-3'；Fv-R4：5'-TAC AAC TCC CAA ACC CCT GTG AAC ATA C-3'。Fp-F3：5'-GTTT TAC TAC TAC GCTATG GAA GCT-3'；Fp-R3：5'-CGA GTT TAC AAC TCC CAAACC CCT-3'。预期扩增产物长度为400 bp。25 µL 反应体系为：DNA 2 µL、TaqPCR Master Mix 12.5 µL、上下游引物各2.5 µL (10 µmol/L)，灭菌ddH2O 5.5 µL。PCR 扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，63℃退火15 s，72℃延伸30 s，30 个循环；最后72℃延伸10 min。电泳检测扩增产物，阳性克隆经PCR鉴定后送华大基因测序。登录Genbank对所得序列进行BLAST检索，利用DNAMAN v6.0软件进行核苷酸序列一致性分析。根据比对结果从GenBank数据库获得其他甘蔗梢腐病病原菌的rDNA-ITS 序列，应用MEGA 6.0 软件构建系统进化树，采用Neighbor-Joining 法建树，模式选择Kimura 2-parameter，自举检测(bootstrap)重复1000 次，以甘蔗黑穗病菌Sporisorium scitamineum（GenBank 登录号：EF185083）为外群。

1.2.3 甘蔗褐条病病原分子检测 分别用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行ITS序列PCR扩增，引物gpd1(CAACGGCTTCGGTCGCATTG)和gpd2(GCCAAGCAGTTGGTTGTGC)进行GPDH 序列PCR扩增。25µL 反应体系：ddH2O 8µL、2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 µL、上下游引物各1 µL (10 µmol/L)，DNA模板2.5µL。ITS和GPDH基因PCR扩增程序均为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。电泳检测扩增产物，阳性PCR产物送华大基因测序。测序结果首先在NCBI 进行BLAST 检索，与NCBI 上已知序列进行同源比对，然后用DNAMEGA 6.0 软件进行序列分析并构建系统进化树，确定其分类地位。

1.2.4 甘蔗锈病病原分子检测 参照文献[31]和[16]的方法进行锈病病原检测、测序及系统进化分析，确定其分类地位。

1.3 甘蔗品种自然抗性调查

于2015—2020年7—10月发病期，分别对临沧、玉溪、版纳、普洱、红河、保山、德宏等低纬高原蔗区主栽和主推品种新植/宿根病情进行调查。

甘蔗梢腐病每个品种随机取3 点，每点顺序调查100株有效蔗株，记录总调查株数及病株数，计算自然病株率，见公式(3)。

参照国家糖料产业技术体系病虫害研究室(2012)的划分方法，并作修改，根据各品种自然病株率按1～5级分级标准进行甘蔗梢腐病自然抗性评价，具体为1级：病株率0%，高抗；2级：病株率0.1%～10.0%，抗病；3级：病株率10.1%～20.0%，中抗；4 级：病株率20.1%～40.0%，感病；5级：病株率40.1%～100.0%，高感。

甘蔗褐条病每个品种随机取3 点，每点顺序调查100 株有效蔗株病情。参照杨子林等[29]按1～6 级分级标准进行自然抗性评价，具体为1 级：叶片无病斑，高抗；2 级：病斑占叶面积＜10%，抗病；3 级：病斑占叶面积11%～25%，中抗；4 级：病斑占叶面积26%～40%，中感；5 级：病斑占叶面积41%～65%，感病；6 级：病斑占叶面积66%～100%，高感。

甘蔗锈病每个品种随机取3点，每点顺序调查100株有效蔗株病情，参照Costet 等[32]的评价方法按1～9级分级标准进行自然抗性评价。

1.4 甘蔗产量和糖分损失测定

于甘蔗成熟收获期分别选择为害区和未为害区采用3点取样，每点66 m2，收砍称量蔗茎产量，计算相对产量损失率。计算见公式(4)。

于甘蔗成熟期选择为害区和未为害区采用3点取样，每点随机选取健株10株、病株10株，按中国甘蔗糖业标准化与质量检测中心制定的二次旋光法，测定分析各样品品质指标，按“损失量=未为害区-为害区”计算各指标损失量。

2 结果与分析

2.1 低纬高原甘蔗中后期灾害性真菌病害种类及分布

通过对临沧、玉溪、版纳、普洱、红河、保山、德宏、文山等主产蔗区调查分析，云南低纬高原蔗区甘蔗中后期灾害性真菌病害主要有：甘蔗梢腐病、甘蔗褐条病、甘蔗锈病共3种，它们广泛分布于云南低纬高原蔗区（表1）。其中，以甘蔗梢腐病暴发成灾趋势明显，感病品种发病严重，平均病株率高达81.2%（表2），常使大量蔗茎枯死，是造成减糖减产最严重的第一大病害。

表1 3种甘蔗中后期灾害性真菌病害地理分布

2.2 为害损失

3种甘蔗中后期灾害性真菌病害发生情况调查及蔗茎产量和品质测定结果如表2。从表2可以看出，不同蔗区3 种病害发生为害程度不一、不同为害程度甘蔗产量损失和品质影响不一，受害蔗株的糖分、锤度、重力纯度均显著低于健康蔗株，还原糖则显著高于健康蔗株。

表2 3种甘蔗病害为害对甘蔗产量和品质的影响

甘蔗梢腐病病株率为63.3%～95%，平均81.2%；甘蔗实测产量相对损失率为30.2%～48.5%，平均38.43%；甘蔗糖分减少2.63%～5.21%、平均3.54%；锤度降低2.4～4.69°BX、平均3.54°BX；重力纯度降低1.99%～8.63%、平均5.37%，而还原糖则增加0.05%～0.6%、平均0.15%。

甘蔗褐条病病情指数为82.2～86.5，平均84.7；甘蔗实测产量相对损失率为19.0%～32.8%，平均25.6%；甘蔗糖分减少1.38%～3.71%、平均2.82%，锤度降低1.16～3.36°BX、平均2.67°BX，重力纯度降低2.78%～7.74%、平均5.09%，而还原糖则增加0.0%～0.52%、平均0.35%。

甘蔗锈病病情指数为81.1～85.6，平均83.6；甘蔗实测产量相对损失率为17.3%～31.7%，平均24.9%；甘蔗糖分减少1.48%～4.24%、平均3.11%，锤度降低1.38～4.79°BX、平均3.18°BX，重力纯度降低3.96%～10.11%、平均6.99%，而还原糖则增加0.02%～0.3%、平均0.1%。

调查及测定结果总体趋势表明，随着为害率（病株率或病情指数）上升，产量损失增大，两者呈极密切相关性。3 种病害发生为害严重影响甘蔗品质，导致出糖率降低，吨糖生产成本上升，糖厂经济效益受损。

2.3 低纬高原甘蔗中后期灾害性真菌病害病原类群

分子鉴定结果表明，低纬高原云南蔗区，甘蔗梢腐病病原菌为镰刀菌F.verticillioides和F.proliferatum，且存在复合侵染现象。7 份复合侵染样品的F.verticillioides（GenBank登录号：MZ126549-MZ126555）和F.proliferatum（GenBank 登录号：MZ102259-MZ102265）序列与GenBank 中公布的F.verticillioides菌株20（GenBank登录号：KU508286）和F.proliferatum德宏菌株（GenBank 登录号：KJ629482）的同源性分别为98.6%～100%和100%。系统进化树显示，云南甘蔗梢腐病病原菌主要分为F.verticillioides组和F.proliferatum组。F.verticillioides组中，除‘ROC 25’（云南澜沧）和‘福农10-1405’（云南弥勒）处于一个独立小分支上外；其余5 个复合侵染样品与不同地理来源F.verticillioides菌株聚为一组，且与F.oxysporum广西菌株的亲缘关系较近，而所有不同地理来源的F.proliferatum菌株聚为另一组。

分子鉴定结果显示，低纬高原云南蔗区，甘蔗褐条病病原菌为狗尾草平脐蠕孢B.setariae，其ITS序列(登录号：MW466590-MW466591)与狗尾草平脐蠕孢B.setariae模式菌株CBS 141.31（登录号：EF452444）相似性达99.47%，与菌株CBSHN01（登录号：GU290228）相似性达100%；GPDH 序列(登录号：MW473721-MW473722)与B.setariae模式菌株CBS 141.31（登录号：EF513206）相似性达99.83%，与菌株CPC28802（登录号：MF490833）相似性达100%。基于ITS 和GPDH基因序列构建系统发育树，发现菌株BS1 和BS2 与B.setariae处于同一分支，亲缘关系最近。

分子鉴定结果表明，来源于云南勐海的4 份病样病原为P.kuehnii，其核苷酸序列（GenBank 登录号：KP201840-KP201843）与GenBank中登录的P.kuehnii相应核苷酸序列（GenBank 登录号：GU058021 和GQ283004-GQ283009）相似性在99.9%以上，并在系统发育树中聚为一簇；来源于云南保山、临沧、西双版纳、普洱、文山的53份病样病原为P.melanocephala，它们的核苷酸序列（GenBank 登录号：KP201824-KP201839，KU886334-KU886368，KU 896993-KU 896994）与GenBank 中登录的P.melanocephala相应核苷酸序列（GenBank 登录号：GU058001 和JX036025）相似性在99.8%以上，在系统发育树中处于同一分枝。

2.4 甘蔗品种自然抗性

34个主栽品种中，对梢腐病表现高抗到中抗的有18个，占52.9%，感病到高感的有16个，占47.1%；对褐条病表现高抗到中抗的有24个，占70.6%，中感到高感的有10个，占29.4%；对锈病表现高抗到中抗的有25个，占73.5%，中感到高感的有9个，占26.5%。综合分析结果显示，‘粤糖83-88’、‘川糖61-408’、‘桂糖21号’、‘云引10 号’、‘柳城03-182’、‘云引58 号’、‘粤糖79-177’、‘云蔗05-51’、‘桂糖36号’、‘新台糖16号’等10个主栽品种对3 种病害均具有优良抗性；而‘柳城03-1137’、‘桂糖42号’对3种病害均感病（表3）。

由表3可知，60个新品种中，对梢腐病表现高抗到中抗的有35 个，占58.3%，感病到高感的有25 个，占41.7%；对褐条病表现高抗到中抗的有32 个，占53.3%，中感到高感的有28 个，占46.7%；对锈病表现高抗到中抗的有41 个，占68.3%，中感到高感的有19个，占31.7%。综合分析结果显示，‘桂糖11-1076’、‘闽糖12-1404’、‘福农09-2201’、‘福农09-71111’、‘桂糖06-1492’、‘桂糖08-1180’、‘云蔗11-1074’、‘桂糖06-2081’、‘桂糖08-1589’、‘粤甘48号’、‘柳城09-15’、‘云蔗11-1204’、‘福农07-3206’等13 个新品种对3 种病害均具有优良抗性；而‘柳城07-506’、‘粤甘52号’、‘海蔗28号’、‘粤甘43号’等4个新品种对3种病害均感病。

表3 甘蔗品种对3种甘蔗病害的自然抗性

续表3

续表3

3 讨论

云南是中国第二大糖料基地，地处低纬高原(97°31’E—106°11’E，21°8’N—29°15’N)，气候复杂多变[1]。近年来多雨高湿甘蔗中后期灾害性真菌病害暴发为害成灾，减产减糖严重[2-3]。而至今有关低纬高原甘蔗中后期灾害性真菌病害的种类、病原类群、为害损失及致灾因子等研究报道甚少，甘蔗病害的科学有效防控缺乏基础和科学依据。本研究通过对临沧、玉溪、版纳、普洱、红河、保山、德宏、文山等低纬高原蔗区调查检测和测定分析，探明了低纬高原甘蔗中后期灾害性真菌病害种类及病原类群，掌握了其为害损失及灾害特性，明确了不同甘蔗品种抗病性，为低纬高原甘蔗病害防控提供了依据。调查表明，低纬高原云南蔗区甘蔗中后期灾害性真菌病害有甘蔗梢腐病、甘蔗褐条病、甘蔗锈病共3 种，普遍存在梢腐病+褐条病+锈病、梢腐病+褐条病、梢腐病+锈病、褐条病+锈病2 种或3种病害复合侵染现象，且3种病害发生期、灾害特性不一，甘蔗锈病6—9月发生、甘蔗梢腐病7—12月发生、甘蔗褐条病8—12月发生，防治上难度大，技术性强。

甘蔗梢腐病可由多种镰刀菌引起，目前已报道的有7 种，分别为Fusarium sacchari、F.verticillioides、F.proliferatum、Fusarium subglutinans、Fusarium andiyazi、Fusarium incarnatum和Fusarium oxysporum[9-11]。不同国家和蔗区的梢腐病病原菌种群及优势种存在差异，马来西亚为F.sacchari、F.proliferatum和F.subglutinans，优势种为F.sacchari[12]。伊朗为F.verticillioides、F.proliferatum和F.subglutinans，优势种为F.verticillioides[9-10]。南非为F.sacchari、F.proliferatum和F.andiyazi，优势种为F.sacchari[33]。菲律宾为F.sacchari、F.proliferatum、F.incarnatum、F.verticillioides和F.subglutinans，优势种为F.sacchari[11]。本研究查明低纬高原云南蔗区甘蔗梢腐病病原菌为镰刀菌F.verticillioides和F.proliferatum，优势种为F.verticillioides，这与Lin等[13]和郭强等[18]的研究结果相吻合。而有关甘蔗褐条病病原菌的研究报道甚少，钱双宏等[8]报道了海南甘蔗褐条病病原为平脐蠕孢属Bipolaris。目前，仅有Raza等[34]结合形态及分子鉴定，在广西、广东甘蔗叶片病斑上发现狗尾草平脐蠕孢B.setariae，本研究也表明低纬高原云南蔗区甘蔗褐条病病原菌为狗尾草平脐蠕孢B.setariae。本研究在云南勐海蔗区发现引起甘蔗黄锈病的屈恩柄锈菌P.kuehnii，并证实引起甘蔗褐锈病的黑顶柄锈菌P.melanocephala是低纬高原云南蔗区优势种。P.kuehnii一旦流行常危害成灾，澳大利亚和美国每年因此病经济损失超过17.7亿美元和4亿美元[35-36]。现今，中国甘蔗抗锈病评价，都只是针对P.melanocephala[26]，今后应调整抗甘蔗锈病育种策略，加强针对P.kuehnii的抗病评价筛选。

研究结果显示，目前大面积种植和主推的‘粤糖93-159’、‘新台糖25号’、‘柳城03-1137’、‘桂糖42号’、‘粤糖60号’、‘云引3号’、‘德蔗03-83’、‘新台糖1号’、‘川糖79-15’等品种高度感病，这是近年低纬高原云南蔗区甘蔗中后期灾害性真菌病害暴发成灾的主要诱因，部分主栽品种抗性鉴定结果与王泽平等[37]鉴定的抗病性存在差异，如高感品种‘粤糖93-159’、‘柳城03-1137’、‘桂糖42号’在广西表现为抗病，这是否与各地病菌群体、致病力及鉴定方法有关，尚待进一步研究；而近年选育的‘桂糖11-1076’、‘闽糖12-1404’、‘福农09-2201’、‘福农09-71111’、‘桂糖06-1492’、‘桂糖08-1180’、‘云蔗11-1074’、‘桂糖06-2081’、‘桂糖08-1589’、‘粤甘48 号’、‘柳城09-15’、‘云蔗05-51’、‘云蔗11-1204’、‘福农07-3206’等14 个优良品种（系）高度抗病，建议生产上合理布局大力推广应用这些抗病品种。

调查及测定结果表明，梢腐病实测产量相对损失率平均为38.43%，最多48.5%；糖分平均降低3.54%、最多5.21%；重力纯度平均降低5.37%，最多8.63%。褐条病实测产量相对损失率平均为25.6%，最多32.8%；糖分平均降低2.82%、最多3.71%；重力纯度平均降低5.09%，最多7.74%。锈病实测产量相对损失率平均为24.9%，最多31.7%；糖分平均降低3.11%、最多4.24%；重力纯度平均降低6.99%，最多10.11%。黄鸿能等[7]指出东莞糖厂蔗区梢腐病为害引起的产量损失在10%～20%，糖分降低0.56%，重力纯度降低3%。Dohare 等[38]报道梢腐病为害可导致产量下降24.9%，糖分减低0.56%。由此可见，目前低纬高原云南蔗区甘蔗中后期灾害性真菌病害为害造成甘蔗产量及糖分损失十分严重，产量损失巨大，严重影响甘蔗品质，导致出糖率降低，吨糖生产成本上升，糖厂经济效益受损。因此，切实加强甘蔗中后期灾害性真菌病害精准监测和防控将是甘蔗产业提质增效和高质量发展的重要任务。

4 结论

本研究结果表明，云南低纬高原蔗区甘蔗中后期灾害性真菌病害有梢腐病、褐条病、锈病3 种，存在复合侵染；梢腐病菌为镰刀菌F.verticillioides和F.proliferatum，优势种为F.verticillioides，褐条病菌为狗尾草平脐蠕孢B.setariae，锈病菌为屈恩柄锈菌P.kuehnii和黑顶柄锈菌P.melanocephala，优势种为P.melanocephala；34 个主栽品种中，对梢腐病、褐条病和锈病高抗到中抗分别有18 个、24 个、25 个；60 个新品种中，对梢腐病、褐条病和锈病高抗到中抗分别有35个、32个、41个。其中，‘桂糖11-1076’、‘闽糖12-1404’、‘福农09-2201’、‘福农09-71111’、‘桂糖06-1492’、‘桂糖08-1180’、‘云蔗11-1074’、‘桂糖06-2081’、‘桂糖08-1589’、‘粤甘48 号’、‘柳城09-15’、‘云蔗05-51’、‘云蔗11-1204’、‘福农07-3206’等新品种高度抗病。梢腐病、褐条病和锈病实测产量相对损失率平均分别为38.43%、25.6%、24.9%，最多分别为48.5%、32.8%、31.7%；甘蔗糖分平均分别降低3.54%、2.82%、3.11%，最多分别降低5.21%、3.71%、4.24%。