陈逢玲，于 航，常丽娜，孙 卓，林红梅，杨利民

（吉林农业大学中药材学院/省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室，长春 130118）

防风Saposhnikoviadivaricata（Turcz.）Schischk.，为伞形科多年生草本药用植物，以干燥根入药[1]，是我国常用大宗中药材之一。产于东北地区的防风，又称“关防风”，主要分布于黑龙江安达、泰康，吉林洮安，辽宁昭盟、铁岭等地区[2]。供给于市场的关防风主要以人工栽培为主[3]。近年来由于关防风人工栽培技术体系不够完善，导致关防风病害的发生日趋严重，其中，由立枯丝核菌RhizoctoniasolaniKühn引起的关防风立枯病，可危害叶、茎、枝条甚至整株[4]。目前，多采用化学途径对关防风立枯病进行防治，通过施用甲基托布津、多菌灵等化学农药，可在一定程度上控制立枯病的发生与发展，但频繁施用化学药剂，易造成农药残留和环境污染等问题[5]，极大限制了关防风种植业的可持续发展[6]。因此，寻求一种对关防风立枯病安全有效的防治手段，成为了关防风种植业亟待解决的问题。

生物防控作为一种绿色安全有效的病害防控手段，已在生态农业领域中得到广泛应用，同时也是药用植物病害防控领域的主要研究热点[7,8]。开展植物病害生物防控工作的前提，是从自然生境中获得高效的拮抗菌株[9]。其中，高菲等[10]从健康草莓的根际土壤中获得的多粘类芽胞杆菌PeanibacillusploymyxaGF-98可使胶孢炭疽病菌生长畸形；孙卓[11]从人参根际土壤中筛选出的一株甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicusSZ-3可显著抑制立枯丝核菌的生长；游成真等[12]从黄瓜根际土壤中筛选出的3株解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens可高效防治黄瓜立枯病。这些研究结果均表明了从植物根际土壤中分离筛选出的拮抗细菌具有良好的生防潜力，已成为植物病害生物防控的优良菌源之一[13]。

目前，关于关防风拮抗菌的研究鲜有报道，且都只是针对于关防风内生菌的研究[14,15]，而对关防风根际土壤细菌的研究还未见报道，故本研究从关防风根际土壤中分离筛选拮抗细菌，并对其进行抑菌能力和定殖能力测定，将筛选出的拮抗菌株，用于关防风立枯病的防治研究，并对能力较强的拮抗细菌进行鉴定。旨在为关防风立枯病的生物防控研究提供优质菌源，为我国药用植物病害防控相关研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试病原真菌 关防风立枯病病原真菌：立枯丝核菌R.solani，用于拮抗细菌的筛选。9种病原真菌：关防风灰霉病病原真菌灰葡萄孢菌BotrytiscinereaPers.ex Fr.，关防风根腐病病原真菌木贼镰刀菌Fusariumequiseti（Corda）Sacc.，关防风疫病病原真菌恶疫霉菌Phytophthoracactorum（lebert et Cohn) J.Schroet.，五味子根腐病病原真菌尖孢镰刀菌FusariumoxysporumSchlecht.，五味子黑斑病病原真菌鹅掌楸链格孢菌AlternarialiriodendraT.Y.ZhangetJ.Z.Zhang，五味子茎基腐病病原真菌腐皮镰孢菌Fusarium solani（mart.）App.etWollenw，细辛叶枯病病原真菌槭菌刺孢菌Mycocentrosporaacerina（Hartig）Deighton.，刺五加黑斑病病原真菌细极链格孢菌Alternariatenuissima（Fr）Wiltshire，细辛菌核病病原真菌核盘菌SclerotiniaasariWu et C.R.Wang.，用于拮抗细菌抗菌谱测定。以上病原真菌均由吉林农业大学植物病理实验室提供。

1.1.2 供试土壤样品 于吉林省长春市吉林农业大学药园（E 125°24′59″、N 43°48′24″、海拔251 m），吉林省白城市黑水镇（E 122°52′10.43″、N 45°11′39.01″、海拔 152 m），吉林省洮南市永茂林场（E 122°12′38.32″、N 45°31′58.59″、海拔224 m）的健康关防风种植地，采集关防风根际土壤，4 ℃保存、备用。

1.1.3 供试培养基 （1）牛肉膏蛋白胨（NA）培养基[16]，马铃薯葡萄糖（PDA）培养基[17]。（2）硝酸盐肉汤培养基、西蒙氏柠檬酸盐培养基、V-P培养基、淀粉水解培养基和明胶水解培养基等鉴定培养基[18]。

1.1.4 主要试剂和仪器 利福平（Rifampicin）（北京索莱宝科技有限公司），50%甲基托布津可湿性粉剂800倍液（四川润尔科技有限公司），哈茨木霉菌剂（潍坊奥奇生物科技有限公司，10亿CFU/g），枯草芽胞杆菌菌剂（山东鲁抗生物农药有限责任公司，1000亿CFU/g），细菌生理生化鉴定管（青岛海博生物科技有限公司），细菌基因组试剂盒（TaKaRa公司），DNA Marker和细菌引物（生工生物工程（上海）股份有限公司），人工气候箱（哈尔滨东联电子科技有限公司），PCR仪（Rockwell Allen-Bradley公司），水平电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

1.2 土壤细菌的分离

采用稀释平板法分离土壤细菌[19]。鲜土样品风干后，过20目筛。称取10 g土样放入装有玻璃珠与90 mL无菌水的三角瓶中，30 ℃、180 r/min充分振荡20 min，混匀后静置5 min，制得土壤悬液。按10-3、10-4、10-5梯度制成稀释液，分别吸取200 μL各稀释液在NA平板均匀涂布，每处理3次重复，平板倒置于恒温培养箱内32 ℃暗培养24～48 h。根据菌落形态、颜色、边缘，可溶性色素等特征挑取不同的细菌菌落，进行NA平板划线纯化，编号，4 ℃保存，备用。

1.3 拮抗细菌筛选

1.3.1 滤纸片法初筛[20]将供试细菌接种于NA液体培养基中，32 ℃、180 r/min振荡培养36 h，制得细菌发酵液，调整含菌量为108CFU/mL，置于室温下备用。将立枯丝核菌制成菌饼（直径8 mm）接种至PDA平板正中央，同时将4片灭菌滤纸圆片（直径8 mm）对称置于距平板中心约25 mm处的4个角点上，每片点接20 μL细菌培养液，对照组点接20 μL NA培养液，每处理3次重复，置于30 ℃培养箱暗培养，待对照组菌落长满平板，筛选出有明显拮抗作用的细菌菌株进行复筛。

1.3.2 牛津杯法复筛[21]无菌滤液的制备：将上述细菌发酵液，在4 ℃条件下，7000 r/min离心20 min，收集上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤掉菌株菌体后，制得无菌滤液，4 ℃保存备用。

将立枯丝核菌制成菌饼（直径8 mm）接种至PDA平板正中央，无菌条件下将4个无菌牛津杯（规格：内径6 mm、外径8 mm、高10 mm）放于距平板中心约25 mm的4个对称角点，每杯接入200 μL无菌滤液，对照组接入20 μL NA培养液，每处理3次重复，置于30 ℃培养箱暗培养，待对照组菌落长满平板，观察处理组有无抑菌带产生，测量、记录处理组真菌菌落生长直径（十字交叉法），计算供试细菌滤液的抑菌率，抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

1.3.3 拮抗细菌抗菌谱测定 将1.1.1中的9种代表植物病原真菌按1.3.1滤纸片法进行拮抗细菌抗菌谱的测定，每处理3次重复，置于30 ℃培养箱暗培养，待对照组菌落长满平板，计算抑制率。

1.4 抗利福平（Rif）标记菌株的筛选

采用抗生素标记法[22]，取拮抗细菌发酵液10 mL接种在含10 μg/mL Rif的50 mL NA培养液中。32 ℃、180 r/min振荡培养2～3 d，如培养液变浑浊，则从含10 μg/mL Rif的培养液中再次吸取10 mL菌液接入20 μg/mL Rif的培养液中，之后逐渐增加利福平浓度，使拮抗细菌逐步在浓度为40、80、100、150、200、300 μg/mL Rif的NA培养液中稳定生长，然后将含300 μg/mL Rif的菌液涂布于含300 μg/mL Rif的NA固体培养基中，筛选出与原始菌株形态变化不大的标记菌株进行下一步试验。

1.4.1 标记菌株遗传稳定性检测 将标记菌株在NA培养基（不含Rif）中继代培养10代后，涂布于含300 μg/mL Rif的NA培养基平板，观察是否能正常生长。

1.4.2 标记菌株拮抗稳定性检测 采用滤纸片法，以原始菌株为对照，观察抑菌率是否存在差异。

1.5 抗利福平标记菌株在土壤中的定殖

采用拌土接种法[23]，把育苗基质装入育苗盆中，每盆300 g土，并向基质中注入30 mL标记菌株发酵液（初始菌量108CFU/g）均匀拌土，3次重复处理，室温下放置，每隔7 d定期取样，采用土壤稀释法，将土壤稀释液涂布在含300 μg/mL Rif的NA培养基平板上，计算含菌量。

1.6 拮抗细菌对盆栽防风的防效研究

立枯丝核菌菌丝悬浮液的制备：参照刘佳等[24]和鲜泽轩[25]方法加以改进，将3～4块直径8 mm的立枯丝核菌菌饼，置于装有100 mL PDA液体培养基的250 mL锥形瓶中，25 ℃、180 r/min振荡培养3 d，过滤，吸干水分后称量菌丝的重量，加入灭菌水配置成浓度为10 g/L的菌丝悬浮液。

拮抗细菌发酵液：将定殖效果良好的拮抗细菌SC-32和SC-127分别接种于NA液体培养基中，32 ℃、180 r/min振荡培养4 d，用灭菌水调整含菌量为108CFU/mL，置于室温下备用。

设置病原菌对照组（接种菌丝悬浮液），菌剂对照组（哈茨木霉菌剂/枯草芽胞杆菌菌剂（菌剂浓度稀释为108CFU/mL）与菌丝悬浮液混合接种）、农药对照组（甲基托布津800倍液与菌丝悬浮液混合接种）、试验组（拮抗细菌发酵液和菌丝悬浮液混合接种），选取长势一致且健康的一年生关防风植株，采用针刺涂抹法[26]接种菌液各15 mL，每组8盆，每盆2株。35 d后进行病害调查，计算病情指数和防治效果。

关防风立枯病病情分级参照张华梦等[27]，分为6级：0级：无病；1级：病斑面积占叶片面积的比例≤12.5%；2级：12.5%＜病斑面积占叶片面积的比例≤25.0%；3级：25.0%＜病斑面积占叶片面积的比例≤50.0%；4级：50.0%＜病斑面积占叶片面积的比例≤75.0%；5级：75.0%＜病斑面积占叶片面积的比例＜100.0%；6级：病斑面积占叶片面积的 100.0%。病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

1.7 拮抗细菌的鉴定

1.7.1 形态学鉴定 将拮抗细菌划线接种于NA培养基上，30 ℃暗培养24 h，观察菌落形态，主要包括菌落颜色、透明度、边缘特征等，并进行革兰氏染色观察菌体形态及芽胞染色观察有无芽胞。

1.7.2 生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[28]和《伯杰细菌鉴定手册》[29]，采用细菌生理生化鉴定管对糖醇利用、硝酸盐还原、甲基红、V-P试验、淀粉水解、明胶液化反应、H2S的产生等生理生化指标进行试验。

1.7.3 分子鉴定 采用细菌基因组试剂盒提取拮抗细菌基因组DNA。采用细菌16S rDNA通用引物16S1F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和16S1R（TACGGCTACCTTGTTACGACTT）扩增16S rDNA基因序列[30]。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，根据测序结果在NCBI进行同源性比较分析，用MEGA 5.0软件采用Neighbor-joining算法构建16S rDNA基因序列的系统发育树，自展次数设定为1000，确定拮抗菌株的系统发育学地位。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌的分离和拮抗细菌筛选

采用稀释平板法，从关防风根际土壤中共分离出156株细菌，编号为SC-1至SC-156。初筛获得38株对关防风立枯病病原菌具有明显拮抗效果的细菌菌株，占分离菌株总数的24.36%；复筛结果表明，拮抗细菌的无菌滤液对立枯丝核菌具有拮抗抑制作用的为12株（表1），抑菌率可达到71.38%，抑菌带宽最大为10.63 mm，将抑菌率高于65%的4株拮抗细菌进行下一步研究。

表1 拮抗细菌无菌滤液对立枯丝核菌的抑制效果Table 1 The inhibiion effect of sterile filtrate of antagonistic bacteria on R.solani

2.2 拮抗细菌抗菌谱测定

抗菌谱结果表明（表2），4株拮抗细菌对9种供试病原菌表现出不同的抑菌能力，对灰葡萄孢菌、恶疫霉菌、鹅掌楸链格孢菌、腐皮镰刀菌、槭菌刺孢菌表现出较强的抑菌效果，抑菌率均大于80%，其中对恶疫霉菌拮抗效果最好，抑菌率均大于85%，而对于五味子尖孢镰刀菌和细辛核盘菌的抑菌效果较差，抑菌率在72.68%～79.40%。其中，菌株SC-32和SC-127对9种供试病原菌均表现出较强的广谱抑菌效果，抑菌率均大于75%，因此选择SC-32和SC-127进行下一步定殖试验。

2.3 抗利福平标记菌株的筛选

菌株SC-32和SC-127均能在含300 μg/mL Rif的NA固体培养基上稳定生长且与原始菌株形态、颜色相同。并且在不含Rif的NA固体培养基上连续传代10代后，均能在含300 μg/mL Rif的NA固体培养基上正常生长，其培养液对关防风立枯丝核菌仍具有抑制作用，且与原始菌株的抑制效果基本相同（图1），具有遗传稳定性和拮抗稳定性。

图1 菌株SC-32和标记菌株与原始菌株抑菌效果对比Fig.1 Comparison of antibacterial effect between SC-32 and SC-127 labeled strains and original strains

2.4 抗利福平标记菌株在土壤中的定殖

菌株SC-32和SC-127在土壤中定殖动态（图2）呈现“先减后增再趋于平稳”的趋势。菌株SC-32接种0～14 d后，土壤中标记菌株数量明显下降，但14 d后土壤的含菌量逐渐增加，于第21 d达到峰值，为5.31×107CFU/g，为14 d时的3.23倍，往后开始逐渐减少，并于28 d后土壤含菌量趋于稳定；菌株SC-127接种0～7 d后，土壤中标记菌株数量明显下降，但7 d后土壤的含菌量逐渐增加，于第14 d达到峰值，为6.58×107CFU/g，为7 d时的2.05倍，往后开始逐渐减少，并于28 d后土壤含菌量趋于稳定；35 d时，菌株SC-32和菌株SC-127在土壤中的含菌量仍能达到2.93×107和7.83×106CFU/g。

图2 菌株SC-32和SC-127在土壤中的定殖动态Fig.2 The colonization dynamic of SC-32 and SC-127 in soil

2.5 拮抗细菌对盆栽防风的防效研究

菌株SC-32和SC-127对关防风立枯病的盆栽防效如表3所示，结果表明，接种35 d后，单接立枯丝核菌的关防风植株病情指数为 46.91，其他处理组的病情指数均较单接立枯丝核菌显著降低。其中，立枯丝核菌与拮抗细菌SC-32混合接种35 d后，其防效较接种哈茨木霉菌剂、枯草芽胞杆菌菌剂和甲基托布津分别提高了26.09%、30.43%和13.05%；立枯丝核菌与拮抗细菌SC-127混合接种35 d后，其防效较接种哈茨木霉菌剂、枯草芽胞杆菌菌剂和甲基托布津分别提高了32.00%、36.00%和20.00%；但各处理组之间防效差异不显著。综上可得，拮抗细菌SC-32和SC-127对关防风立枯病均具有较好的防治效果，其中SC-127较SC-32的防治效果好。

表3 拮抗细菌对关防风立枯病的防治效果Table 3 Control effect of antagonistic bacteria against the pathogen of S.divaricata seedling damping-off

2.6 拮抗细菌的鉴定

2.6.1 形态学鉴定 菌株SC-32在NA固体培养基上培养24 h后，菌落乳白色，有黏性，质软，中心隆起，表面较湿润，不透明，边缘不整齐，菌体杆状，革兰氏染色为阳性，有芽胞；菌株 SC-127菌落乳白色，有黏性，质软，中心隆起，表面湿润，不透明，边缘整齐，镜检菌体为杆状，革兰氏阳性，有芽胞。

2.6.2 生理生化鉴定 生理生化特性测试结果表明（表4）：菌株SC-32和SC-127均能够水解淀粉和明胶，硝酸盐还原反应生成红色化合物，接触酶、乙酰甲基甲醇试验（V-P）、酪蛋白和氧化酶均为阳性，能够利用柠檬酸盐和多种糖原，甲基红反应、丙酸盐、吲哚、苯丙氨酸脱氨酶、氧化酶与硫化氢试验均为阴性，，能在10%含NaCl的NA培养基生长。结合形态学和生理生化鉴定分析，菌株SC-32和SC-127具有典型芽胞杆菌特征。

表4 菌株SC-32和SC-127的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of SC-32 and SC-127

2.6.3 分子鉴定 扩增菌株SC-32和SC-127的16S rDNA基因序列，得到一个1451和1428 bp的PCR产物，提交GenBank注册（登录号为：OK605022和OK605052）并进行NCBI BLAST比对，显示菌株SC-32和SC-127均与贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis相似性最高，可达到99.86%以上；构建16S rDNA基因序列系统发育树显示（图3），菌株SC-32和SC-127与贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis聚为一支。结合形态学分析，生理生化指标，16S rDNA基因序列分析，将菌株SC-32和SC-127鉴定为贝莱斯芽胞杆菌。

图3 基于16S rDNA序列构建的菌株SC-32和SC-127系统发育树Fig.3 phylogenetic tree of SC-32 and SC-127 strain based on 16S rDNA sequence

3 讨论

植物病害生物防控是利用有益生物来抑制或消灭有害生物的一种方法和手段[31]，是不使用化学杀菌剂也可对植物病害进行高效防治且对人类及环境无害的病害防治策略[32]。开展植物病害生物防控的首要任务是筛选出对标靶菌具有良好拮抗效果，且不伤害非标靶菌的特异性并具有多种防病机制的生防菌[33]。目前，在关防风病害生物防控研究中，对多种标靶菌具有拮抗效果的生防菌尚少。陈志垚等[34]获得一株对马铃薯疮痂病菌具有明显拮抗效果的贝莱斯芽胞杆菌BKS104，对8种植物病原真菌均具有抑制效果。本研究以立枯丝核菌为标靶菌，筛选出两株具有良好拮抗效果的菌株SC-32和SC-127，其无菌滤液也具有拮抗活性，说明了菌株SC-32和SC-127分泌的胞外抑菌物质对立枯丝核菌也存在作用机制。抑菌谱结果证实，菌株SC-32和SC-127对细辛叶枯病菌，刺五加黑斑病菌、细辛菌核病菌等9种作物病原真菌均具有抑菌能力，说明其不但对叶部病害病原菌具有拮抗作用，对其他茎、根部病害病原菌同样具有拮抗效果，表现出广谱抑菌活性。表明菌株SC-32和SC-127具有良好生防潜力。同时，从关防风根际土壤分离筛选出的拮抗细菌，保证了关防风拮抗菌源的安全性和可靠性。

盆栽试验证实，菌株SC-32和SC-127均能显著降低关防风立枯病的病情指数，其防效高于菌剂和农药处理组。充分表明SC-32和SC-127对关防风立枯病病具有良好防治效果，与市面上推广的生物菌剂相比更能针对性的防治关防风立枯病，且与化学农药相比，对人和环境无害。

菌株SC-32和SC-127经形态、生理生化、16S rDNA基因序列分析，鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。贝莱斯芽胞杆菌是一类可产生芽胞的非致病菌，对人与动物没有致病性，能够产生多种次级代谢产物，且具有广谱抑菌活性，可抑制多种植物病原菌的生长[35,36]，并对植株具有促生作用，被广泛应用于动植物病害的生物防治[37]。本研究首次发现贝莱斯芽胞杆菌对关防风立枯病具有良好的防效，为关防风立枯病的防治提供了优良菌源。

研究显示，拮抗细菌对植物病害的生防机制存在多样性和协同性，其作用机理包括抑菌、定殖和诱导抗性等诸多方面[38]。本研究发现，SC-32和SC-127虽同为贝莱斯芽胞杆菌，但两株拮抗细菌的抑菌能力和生防效果却存在差异，其相关防病作用的机制可作为下一步试验工作的重点。