张天南，夏泽远，赵林钢，，高文铭，罗 燕

(1.南京中医药大学附属医院，江苏南京 210029；2.南京中医药大学第一临床医学院，江苏南京 210023；3.南京市六合区中医院，江苏南京 211599；4.南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210001)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是全球第九大最常见的癌症类型，2015 年BC 新增病例43 万，感染人数近340 万人[1]. 发病率和死亡率最高的是北美和欧洲，但是BC 发病率在一些东欧和发展中国家也在逐步增加.BC 以浅表(非侵袭性)尿路上皮癌为主，5 年生存率为96%，但肌肉浸润性BC 的患者预后较差，5年生存率仅为35 % ～70 %[2].目前确诊患者中许多患有慢性基础性疾病，致使依靠单一现代医学救治困难颇多[3]，而中医着重整体、辨证论治，充分体现其独到优势，为治疗BC 做出了重要贡献.

古籍中对尿血、血淋等症状的描述，如朱丹溪在《丹溪心法》中指出“大抵小便出血…痛者谓之淋，不痛者谓之溺血”，同现代医学所讲的BC 的典型临床表现一致，故BC 可归属于“尿血”“癃闭”“血淋”的范畴.BC 病机虽并不完全明确，但从临床征候体征、发病历程与古籍的描述，现代中医普遍认同将膀胱肿瘤的病因为湿热之邪入于少阴，而机体本身又正气不足，内外因相结导致疾病[4]. 知柏地黄汤(ZhibaiDihuang decoction，ZBDHD)出自《医宗金鉴》.此方是在六味地黄丸的基础上附加知母、黄柏组成，有滋阴补肾、清热降火的功效，主要用于肝肾阴虚、阴虚火旺之证.ZBDHD 组方中的黄柏有清热解毒，泻火除蒸的功效；山药的主要功效为益肾填精；茯苓的主要功效为淡渗利湿、健脾宁心，以上诸药共用，能够起到滋阴降火、生津除烦的作用[5-6].

网络药理学是一种基于受体理论和生物网络，阐述药物作用及其作用机制的新技术，其开创了一种多组分与多靶点间复杂网状关系的新型模式，为中药方剂药效物质基础及潜在药理机制研究开拓了新思路[7].分子对接技术基于配体的三维结构与受体的空间构象，预测其亲和力、结合模式并打分，挑选出与靶点亲和力最好的化合物[8].本文拟借助网络药理学探寻ZBDHD 治疗BC 的关键药效组分，并将关键组分与疾病靶点进行分子对接，为其临床应用提供理论基础.

1 资料收集与分析方法

1.1 ZBDHD 化学组分收集

借助中药系统药理学分析平台[9]TCMSP(http:/ /tcmspw.com/)、HERB 本草组鉴数据库(http:/ /herb.ac. cn/)、TCMIP(http:/ /www. tcmip. cn/) 检索 ZBDHD 中所含化学成分，并根据文献报道对数据库中的中药组分进行增减，具体参考以下条件:(1)该中药在《中华人民共和国药典》(2015 年版) 中规定的质量标志物；(2)通过CNKI 文献数据库与Web of Science 文献数据库搜索得到的该味药中目前已被研究发现具有明确药理活性或在药物中含量较高的有效成分.

1.2 活性组分筛选及靶点收集

本研究基于ADME(药物吸收、分布、代谢、排泄)模型，参考同类研究[10]，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性指数(drug like index，DL)≥0.18 作为筛选条件，同时导出活性组分的作用靶点.通过UniProt 数据库[10]( https:/ /www. uniprot. org)检索蛋白靶点ID 及靶点名，整理ZBDHD 靶点信息.

1.3 ZBDHD 汤治疗BC 关键靶点的确定

为进一步探究ZBDHD 汤治疗BC 的分子机制，以“bladder cancer”为关键词，通过 GeneCards 数据库(https:/ /www.genecards. org/)收集BC 疾病相关靶点，并将ZBDHD 汤的作用靶点与BC 致病靶点进行映射，获取ZBDHD 汤治疗的关键靶点.

1.4 PPI 网络和 Hub 靶点分析

将关键靶点上传String 数据库，设置研究物种为智人，设置条件为score ＞0.4，使用Cytoscape 软件(3.7.2 版)绘制PPI 网络展示图，并使用CytoHub 插件依据各蛋白之间互作次数显示PPI 网络中最重要的模块，得到PPI 网络的Hub 靶点(核心靶点).

1.5 Hub 靶点的 GO 和 KEGG 富集分析

为了揭示ZBDHD 治疗 BC 的 Hub 靶点在 BC 发病中的GO 和 KEGG 过程，借助 DAVID 6.8(http:/ /david. abcc. ncifcrf. gov/) 对 Hub 靶点进行 GO 和KEGG 富集分析. DAVID 是一个生物信息数据库，整合了生物学数据和分析工具，可对大规模基因ID 或蛋白ID 列表进行基因的差异分析或是通路的富集，帮助用户从中提取生物学信息(GO 分析和KEGG 通路分析).

1.6 组分-Hub 靶点分子对接

将从Pubchem 获取关键药效组分的3D 结构式以*sdf 格式保存，借助 Discovery Studio 4.5 将*sdf 格式文件转化为*mol2 格式. 从 PDB 数据库(https:/ /www.rcsb. org/)下载 Hub 靶点的 3D 结构*PDB 格式，运用Schrödinger(2018)软件进行分子对接验证.首先，将每个Hub 靶点导入平台，进行加氢原子，去除水分子，处理重原子，调整键序等前处理，选用OPLS＿2005 力场进行能量最小化优化处理，直到非氢原子的均平方根偏差(root-mean- square deviation，RMSD)减小为3 nm. 接着，利用Glide 对接模块分析蛋白活性点结合口袋，以各蛋白原配体为中心生成活性格点盒子；其中蛋白和配体间范围设置为1.0/0.8；进行10 次模拟对接，取得分平均值，获取ZBDHD 治疗BC的证据支持.

2 结果

2.1 活性组分的筛选

通过 TCMSP、HERB、TCMIP 数据库检索到 ZBDHD 中所含化学组分共673 个，以OB≥30%且DL≥0.18 为阈值，对673 个组分进行筛选，并结合药典及文献报道对组分进行增删，最终确定ZBDHD 活性组分72 个，其中熟地黄8 个，山茱萸6 个，山药12 个，泽泻 5 个，茯苓 8 个，丹皮 9 个，知母 5 个，黄柏 19 个.

2.2 关键靶点的获取

借助TCMSP 获得ZBDHD 作用靶点221 个，通过GeneCards 数据库获得9296 个BC 疾病相关靶点，以relevancescore≥10 为阈值，确定 BC 相关靶点1416个.如图1 所示，将1416 个疾病靶点与221 个ZBDHD作用靶点进行映射，最终确定了ZBDHD 治疗BC 关键靶点 45 个，包括 INS，IL6，EGFR，MYC，VEGFA 等.

图1 ZBDHD 与BC 交集靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of intersection targets of ZBDHD and BC

2.3 PPI 网络的构建

将45 个关键靶点导入String 数据库，将研究物种为选择为“homo sapiens”，将 minimum required interaction score 设置为大于0.4，构建蛋白互作网络图.再将所得数据导入Cytoscape 3.7.2 软件，绘制45 个关键靶点蛋白间作用关系.如图2A 所示，节点大小与蛋白在PPI 网络中的重要程度成正比，节点颜色由黄至紫代表节点Degree 值逐渐增大. 此后，使用Cyto-Hub 插件确定PPI 网络中最重要的模块，可最终得到子网络的 6 个 Hub 靶点(VEGFA，FOS，MYC，CASP3，CCND1，HIF1A)，如图 2B 所示.

图2 蛋白质-蛋白质网络互作图注:A.45 个关键蛋白的互作网络；B.6 个Hub 靶点的互作网络Fig.2 Protein-protein interaction network diagram

2.4 GO 及 KEGG 富集分析

为了进一步验证潜在作用的靶点，在PPI 网络中，将6 个Hub 靶点信息导入DAVID 6.8 数据库，进行GO 富集分析. 结果显示，6 个 Hub 靶点富集得出759 条GO 富集结果，其中生物功能(BP)702 条，细胞的组成(CC)15 条和分子的功能(MF)42 条，发现Hub 靶点主要富集在生物功能(BP)途径.GO 富集中的Hub 靶点通过激活细胞转录因子，调节细胞生物信号转导，调控葡萄糖代谢，血管生成，MAP 激酶活性，脂多糖介导的信号通路等路径，在细胞外泌体，细胞间隙，细胞核中发挥作用(如图3). 对Hub 靶点进行KEGG 通路分析. 如图4 所示，Hub 靶点主要集中在晚期糖基化终末产物与其受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK 信号通路(MAPK signaling pathway)、甲状腺激素信号通路(Thyroid hormone signaling pathway)、p53 信号通路(p53 signaling pathway)等. 这些通路主要通过炎症、生物代谢途径作用于BC，与PPI 结果一致.

图3 PPI 网络中排名前6 个 Hub 靶点和GO 富集分析Fig.3 Top 6 Hub genes in the PPI network and GO enrichment analysis

图4 Hub 靶点的KEGG 代谢通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway of Hub genes

2.5 分子对接验证

为验证Hub 靶点具体与ZBDHD 哪些成分参与抗BC，将6 个Hub 靶点与ZBDHD 成分依次对接.一般认为配体与受体结合的构象稳定时发生作用的可能性与结合能大小呈负相关，本研究选择结合能≤-6 kJ·mol-1作为判定对接有效的阈值[11-12]. 如图5所示，ZBDHD 集中作用于 CASP3，HIF1A，CCDN1 三个靶点，而对VEGFA，MYC，FOS 的结合效应较弱.筛选获得候选活性化合物9 个，分别为梓醇、密力特苷、毛蕊花糖苷、知母皂苷BII、牡丹皮苷C、芍药苷、儿茶素、苯甲酰基氧化芍药苷、地黄苷D，结构信息见图6，可为抗BC 先导化合物开发提供参考.毛蕊花糖苷与HIF1A 和CCND1 的结合得分最高，与CASP3 的结合得分排名第二，借助Schrödinger 构建毛蕊花糖苷与三个靶点的结合模式图，见图7 ～9.如图7B，毛蕊花糖苷与 HIF1A 的氨基酸残基 ILE233、LYS532、GLU530、GLU261、GLU257 形成氢键相互作用；如图 8B，毛蕊花糖苷与CCND1 的氨基酸残基GLU75、GLN183 形成氢键相互作用；如图9B，毛蕊花糖苷与CASP3 的氨基酸残基 PHE250、GLU248、GLU246、ASP211、ASN208、ARG207 形成氢键相互作用，与残基PHE250 形成Pi-Pi 堆积作用.

图5 分子对接的聚类分析热图Fig.5 The heat map of cluster analysis for molecular docking results

图6 9 个候选活性化合物的分子结构信息Fig.6 The molecular structures of nine candidate active compounds

图7 HIF1A 与毛蕊花糖苷的结合模式图注:A.三维结合模式图；B.平面结合模式图Fig.7 Binding pattern diagram of HIF1A and Verbascoside

图8 CCND1 与毛蕊花糖苷的结合模式图注:A.三维结合模式图；B.平面结合模式图Fig.8 Binding pattern diagram of CCND1 and Verbascoside

图9 CASP3 与毛蕊花糖苷的结合模式图注:A.三维结合模式图；B.平面结合模式图Fig.9 Binding pattern diagram of CASP3 and Verbascoside

3 讨论

BC 仍然是影响泌尿生殖道的主要恶性肿瘤之一，其主要治疗方法是经尿道电切加BCG 膀胱灌注，但此法对于预防肿瘤复发和进展效果并不理想. ZBDHD 出自《医宗金鉴》，姜家康教授临床将其用于BC治疗，取得良好疗效[13].如果能从中药方剂中识别治疗BC 的有效组分，将显著提高患者生存率.

GO 富集中的Hub 靶点通过激活细胞转录因子，调节细胞生物信号转导，调控葡萄糖代谢，血管生成，MAP 激酶活性等路径，在细胞外泌体，细胞间隙，细胞核中发挥作用. 在 KEGG 富集结果表明，通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路可减少膀胱癌细胞的入侵和迁移，并调节膀胱癌细胞凋亡和自噬[14]. 激活MAPK 信号通路，可以增加BC 细胞和线粒体ROS 的生产[15].激活体外和体内的p38/p53/p21 通路，可以抑制BC 细胞生长，并在G1 诱导细胞周期阻塞[16].

分子对接的结果表明，毛蕊花糖苷、梓醇、知母皂苷BII、儿茶素等9 个化合物与关键靶点的结合效应较好.特别是毛蕊花糖苷与HIF1A 和CCND1 的结合打分排名第一，与CASP3 的结合得分在所有中药组分中排名第二，有望成为治疗BC 的候选活性化合物.毛蕊花糖苷来自于地黄，地黄主要含有环烯醚萜苷类、糖苷类、氨基酸类等化学成分，其中入血成分有毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷D、密力特苷、5-羟甲基糠醛、益母草苷等[17]. 现有的多项研究均表明，毛蕊花糖苷在结直肠癌[18]、前列腺癌[19]及口腔鳞状细胞癌[20]等多种癌症类型中都显示出了显著的抗肿瘤细胞增殖作用，是一种有效的抗肿瘤活性成分. 高娟等的研究显示，膀胱癌患者尿液外泌体HIF1A 反义RNA2(HIF1A-AS2)表达水平明显升高，有望成为膀胱癌诊断的潜在生物学标志物[21]，而在结肠癌细胞中，毛蕊花糖苷可显著抑制HIFA 等EMT 标志物的表达，抑制其侵袭和迁移[18].此外，梓醇、知母皂苷BII、儿茶素、地黄苷D 等中药组分也被报道具有不同程度的抗肿瘤[22]或协同增效[23-24]作用，验证了筛选模型的有效性.

综上所述，本研究利用网络药理学和分子对接方法预测ZBDHD 治疗BC 的核心靶点及涉及的生物学通路，推测该方剂通过干预抗炎、调节糖脂代谢及氧化应激等过程发挥治疗作用，为阐明ZBDHD 对BC的作用机制提供了计算机大数据背景下的理论依据.值得注意的是，网络药理学与分子对接技术未能考虑剂量、剂型对药效的影响，阐释ZBDHD 抗BC 作用机制仍需更为深入体内外实验的进行研究.