唐嵩媛，赵琦琦，孙晖*，闫广利*，王喜军，车延柠，张秀玲

1.黑龙江中医药大学/教育部经典名方有效性评价及产业化开发工程研究中心/国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨中药四厂有限公司，黑龙江 哈尔滨 150500

三棱为黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoloniferumBuch.-Ham.的干燥块茎，味辛、苦，性平，归肝、脾二经，具有破血行气、消积止痛的功效，用于癥瘕痞块、痛经、瘀血经闭、胸痹心痛、食积胀痛[1]。《神农本草经疏》记载：“三棱，从血药则治血，从气药则治气，能治一切凝结停滞之坚积也。”[2]《医学衷中参西录》记载：“三棱、莪术为化瘀血之要药，化血之力三棱优于莪术，理气之力莪术优于三棱。”[3]现代药理研究表明，三棱具有抑制血小板聚集及抗血栓、抗动脉粥样硬化、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化等作用[4]。三棱的化学成分复杂，目前已分离鉴定的化合物主要包括苯丙素、有机酸、黄酮、甾体、蒽醌、生物碱、挥发油、二苯基庚烷、脂肪酸等类成分[5]。然而，三棱功效相关的药效物质基础仍不明确，导致目前仍没有建立有效的三棱质量控制方法，《中华人民共和国药典》2020 年版（一部）三棱药材项下仅有性状、显微和薄层鉴别，无明确的成分定性、定量检测标准[1]，难以保障其临床疗效。

由于三棱药效物质基础不明确，对化学成分进行整体表征是控制其质量的必要手段。指纹图谱/特征图谱是中药整体质量控制的有效方法，现已作为中药注射剂[6]、中药配方颗粒[7]、古代经典名方复方制剂[8]、中药创新药[9]的质量标准检测项目，以及作为上市品种质量标准提升和生产全过程质量控制的重要研究内容[10]。三棱的指纹图谱已有报道[11-14]，然而其检测的共有峰或特征峰均为香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对香豆酸等极性有机酸类成分。该类成分虽然具有一定生物活性，但其在药用植物中广泛存在，仍需要增加三棱特征成分的检测，以增强其专属性和质量控制的有效性。本研究系统考察色谱分离和紫外光谱检测条件，建立能够表征三棱药材更多结构类型化学成分的特征图谱，为三棱药材及其制剂的质量控制提供新的方法。

1 材料

ACQUITY 型超高效液相色谱仪，配备光电二极管阵列（PDA）检测器和Empower 色谱工作站（美国Waters 公司）；AE-240 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DA 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

色谱纯乙腈（美国Fisher 公司）；色谱纯磷酸[阿拉丁试剂（上海）有限公司]；色谱纯甲醇（美国Dikma公司）；水为超纯水；10批三棱药材，产地为浙江磐安，批号分别为170101、170102、170103、170104、170105、170106、170107、170108、170109、1701010，均由哈尔滨中药四厂有限公司提供；对照品咖啡酸（批号：11085-201703，纯度：99.7%）、阿魏酸（批号：110773-201915，纯度：99.4%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品对香豆酸（批号：21052604，纯度：99.97%）购自成都普菲德生物技术有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～20%A；5～6 min，20%～35%A；6～10 min，35%A；10～12 min，35%～50%A；12～15 min，50%～75%A；15～16 min，75%～100%A）；检测波长：0～12 min为300 nm，12～16 min为240 nm；柱温：25 ℃；流速：0.4 mL·min-1；进样体积：3 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取三棱粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入75%甲醇20 mL，称定质量，超声提取30 min（频率50 kHz，功率250 W），放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

取对照品咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸适量，精密称定，用甲醇制成质量浓度分别为1.667、1.017、1.305 μg·mL-1的对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样6 次，考察色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果测得各共有峰相对保留时间的RSD 均小于1.0%，相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 精密称定三棱粉末，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按2.1项下色谱条件进样分析，考察色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于1.0%，相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 精密称定三棱粉末，按2.2 项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别在制备后0、2、4、6、8、10、12 h 后按2.1 项下色谱条件采集色谱图，考察色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果测得各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积RSD 均小于3.0%，用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）计算，测得色谱指纹图谱与其所得的共有模式图的相似度均为1.000，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5 特征图谱的建立及相似度评价

取10 批三棱药材样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件采集色谱图，得10批三棱的超高效液相色谱-紫外法（UPLC-UV）图谱。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）进行色谱峰匹配，选择中位数法及多点校正法生成对照图谱（图1）。选择色谱图中分离度较好、峰强度适中的共有色谱峰作为特征峰，共标定11 个共有特征峰，按出峰时间依次标记为1～11号峰。峰4 经对照品比对认定为对香豆酸，该峰峰面积适中，保留时间稳定，以其作为参照峰（S），规定其他峰的相对保留时间：峰1 为0.42 min，峰2为0.77 min，峰3为0.95 min，峰4为1.00 min，峰5为1.07 min，峰6 为1.23 min，峰7 为1.52 min，峰8 为1.59 min，峰9 为1.63 min，峰10 为2.01 min，峰11 为2.64 min。计算各批三棱药材特征图谱与对照图谱的相似度，结果表明，10 批三棱药材特征图谱的相似度分别为0.969、0.991、0.915、0.972、0.967、0.977、0.987、0.987、0.954、0.985，表明10批三棱药材批次间稳定性良好。

图1 10批三棱药材的UPLC-UV图（S1～S10）及对照指纹图谱（R）

2.6 特征峰认定

为考察特征图谱是否具有代表性，通过对照品比对和质谱解析的方法对三棱药材主要特征峰进行认定。按照三棱药材特征图谱分析条件采集咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸的色谱图，通过比较保留时间和紫外光谱图，认定2号峰为咖啡酸，4号峰为对香豆酸，5号峰为阿魏酸，见图2。

图2 代表性三棱药材UPLC-UV特征图谱及混合对照品色谱图

由于难以获得其他三棱成分的对照品，本研究利用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法（UPLC-Q/TOF-MS）对上述三棱指纹图谱的共有峰进行认定。色谱条件参照2.1 项，仅用甲酸代替磷酸，即0.1%甲酸水-乙腈作为流动相，其他参数相同。质谱参数：电喷雾离子源，负离子检测模式下，毛细管电压为2.5 kV；锥孔提取电压为3.0 V；去溶剂气温度为350 ℃；去溶剂气体积流量为700 L·h-1；锥孔气体积流量为50 L·h-1；离子源温度为110 ℃；相对分子质量检测范围m/z50～1200。测得三棱药材UPLC-Q/TOF-MS 总离子流色谱图，与三棱UPLC-UV 指纹图谱比较，根据相对保留时间确定总离子流色谱图中对应的指纹图谱共有峰，见图3。由于峰1和峰3在总离子流色谱图中峰强度较低，而且受其他峰干扰，不能进行认定。采集峰6～11的一级质谱和二级质谱信息，利用一级质谱图提供的准分子离子精确质量和同位素峰比例，计算分子式。在三棱药材已知化学成分中匹配与该分子式一致的化合物，进一步通过解析二级质谱的裂解途径，对匹配的化合物结构进行验证，从而进行峰认定，结果见表1。

表1 三棱特征图谱特征峰的UPLC-Q/TOF-MS分析结果

图3 三棱药材UPLC-Q/TOF-MS总离子流色谱图

峰6 准分子离子m/z685.198 4 [M-H]-，计算分子组成为C30H37O18，与三棱中含有的已知化学成分β-D-(O-乙酰基-O-阿魏酰基)呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷[15-18]分子式一致。二级质谱给出m/z193、175、160 的碎片离子，推测裂解途径见图4。三棱中含有该结构果糖上3 位、6 位阿魏酰基取代的异构体和葡萄糖上2′、3′、4′、6′位乙酰基取代的异构体，仅通过二级质谱不能确定准确的取代位置，因此，初步鉴定峰6为β-D-(O-乙酰基-O-阿魏酰基)呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷。

图4 β-D-(O-乙酰基-O-阿魏酰基)呋喃果糖基-α-D-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷的二级质谱图及裂解途径解析过程

峰7 准分子离子m/z383.114 0 [M-H]-，计算分子组成为C21H19O7，与三棱中含有的已知化学成分1,3-O-二-对-香豆酰基甘油酯[19]分子式一致。二级质谱给出m/z229、211、171 的碎片离子，推测裂解途径见图5。因此，峰7 初步鉴定为1,3-O-二-对-香豆酰基甘油酯。

图5 1,3-O-二-p-香豆酰基甘油酯的二级质谱图及裂解途径解析过程

峰8 准分子离子[M-H]-m/z413.125 8，计算分子组成为C22H21O8，与三棱中含有的已知化学成分1-O-阿魏酰基-3-O-p-香豆酰基甘油酯[19]分子式一致。二级质谱给出m/z193、177、163、145、134、119的碎片离子，推测裂解途径见图6，因此，峰8初步鉴定为1-O-阿魏酰基-3-O-p-香豆酰基甘油酯。

图6 1-O-阿魏酰基-3-O-p-香豆酰基甘油酯的二级质谱图及裂解途径解析过程

峰9 准分子离子m/z443.134 9 [M-H]-，计算元素组成为C23H23O9，与三棱中含有的已知化学成分1,3-O-二阿魏酰基甘油酯[19]分子式一致。二级质谱给出m/z193、175、134 的碎片离子，推测裂解途径见图7，因此，峰9初步鉴定为1,3-O-二阿魏酰基甘油酯。

图7 1,3-O-二阿魏酰基甘油酯的二级质谱图及裂解途径解析过程

峰10 准分子离子m/z861.224 9[M-H]-，计算分子组成为C40H45O21，与三棱中含有的已知化学成分β-D-(1-O-乙酰基-3,6-O-二阿魏酰基)呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷[19]分子式一致。二级质谱给出m/z819（脱乙酰基）、801（脱H2O）、193、175、160 的碎片离子，推测裂解途径见图8。三棱中含有该结构葡萄糖基上2′、3′、4′、6′位乙酰基取代的异构体，仅通过二级质谱不能确定准确的取代位置，因此，峰10初步鉴定为β-D-(1-O-乙酰基-3,6-O-二阿魏酰基)呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷。

图8 β-D-(1-O-乙酰基-3,6-O-二阿魏酰基)呋喃果糖基-O-三乙酰吡喃葡萄糖苷的二级质谱图及裂解途径解析过程

峰11 准分子离子m/z295.227 7[M-H]-，计算分子组成为C18H31O3，三棱中未发现与该分子式一致的已知化学成分。二级质谱如图9 所示，可见分子离子脱去H2O，产生m/z277.217 2 碎片离子，而未见分子离子脱去CO2的碎片离子，推测该化合物含有1 个醇羟基，而不含羧基，不是脂肪酸类化合物。该分子离子中性丢失C9H16产生元素组成为C9H15O3的m/z171.102 3碎片离子。推测C1～C9存在2个双键，并有3 个氧取代位；由C9H16的中性丢失，推测该化合物C10～C18 不含氧原子而且含有1 个双键。由于在C9-C10 键断裂，同时C11 上1 个H 转移到C9，使C10-C11 形成双键，这样能够与C12-C13 双键形成稳定的共轭体系，因此推测C10～C18链上双键位于C12-C13。该化合物分子离子还产生m/z195.138 4 碎片离子，计算分子组成为C12H19O2，为分子离子中性丢失C6H12O 的离子；C6H12O 的中性丢失含有1 个双键，为C6-C7 键断裂时C5 上H 转移至C7 后形成C5=C6 双键，由此推测该化合物分子C1～C6 没有双键，那么另2 个双键存在于C7～C9；m/z195.138 4 碎片离子分子式C12H19O2，而C10～C18 不含氧原子，推测C7～C9 有2 个氧原子，那么C7～C9 的结构为-CO-HC=COH-或-COH=CH-CO-，此结构为稳定的共轭体系，其两端的C-C 键容易断裂，从而在二级质谱上产生中性丢失C9H16、C6H12O 的碎片离子。以-CO-HC=COH-结构说明该化合物的裂解途径见图9。该化合物结构与三棱酸相似，因其化学结构含有烯酮结构，故暂称其为三棱酮。

图9 三棱酮的二级质谱图及裂解途径解析过程

3 讨论

三棱化学成分复杂，包括苯丙素、有机酸、黄酮、甾体、蒽醌、生物碱、挥发油、二苯基庚烷、环二肽、脂肪酸等类化学成分[5]，然而已报道的三棱化学成分指纹图谱仅表征了香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对香豆酸等大极性有机酸类成分[11-13]，主要原因是仅采用254 nm 或300 nm 的检测波长，不能兼顾多种紫外吸收特征的成分。本研究利用PDA 检测器，在200～400 nm 波长采集三棱供试品溶液色谱图，经比较分析发现0～12 min 的色谱图在300 nm 波长下色谱峰信息比较丰富，峰形良好，而在12～16 min 的色谱图在240 nm 波长下可检测到很强的色谱峰，即11 号峰。因此，本研究采用双波长切换扫描的方式采集三棱指纹图谱，0～12 min 在300 nm 波长采集，12～16 min 在240 nm 采集，从而能够采集到更全面的三棱化学成分峰。

为说明本研究所建立的特征图谱能够表征三棱的主要化学成分，进一步利用对照品和UPLC-Q/TOF-MS 对三棱特征图谱的特征峰进行了认定。与以往文献报道的三棱指纹图谱不同，本研究建立的特征图谱除了表征阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸等极性有机酸类成分，还表征了苯丙素乙酰蔗糖酯、苯丙素甘油酯及一个十八碳烯酮成分（三棱酮），表明该指纹图谱能够更全面控制三棱药材的物质基础。三棱具有破血行气、消积止痛的功效，是活血化瘀要药，具有抗血小板凝集和抗血栓作用、抗癌、抗炎镇痛等药理作用[2]，三棱抗癌和心血管方面的活性相关部位是以苯丙素类成分为主的小极性部位[20]，而本研究建立的特征图谱中峰6～10 均属于小极性苯丙素类成分，说明本特征图谱表征了药效相关成分，而以往的三棱指纹/特征图谱中均未表征该类成分。另外，本研究利用UPLC-Q/TOF-MS 技术鉴定峰11 为一种十八碳烯酮，暂称为三棱酮，该化合物峰强度高、含量稳定，可代表三棱高级脂肪族化合物。因此，本研究建立的三棱UPLC-UV特征图谱除了表征大极性的有机酸成分外，还能够表征小极性苯丙素酯类成分及脂肪族化合物，能够更有效地控制三棱药材质量。

4 结论

本研究建立了中药三棱UPLC-UV特征图谱，确定11个特征峰及对照图谱，利用对照品认定了咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸的特征峰，利用UPLC-Q/TOF-MS 鉴定了5 个苯丙素酯类成分特征峰和1 个脂肪族化合物。该指纹图谱更全面地表征了三棱主要化学成分，为三棱药材质量控制提供了新的方法。