鲁 铁，李 登，朱园园，苏正娴，段鹏菲，陈怀中，刘 宇，谢朝晖**

（1.河南城建学院生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036；2.暨南大学生命科学技术学院，广东 广州 510632；3.鲁东大学 农学院，山东 烟台 264025）

血红密孔菌[Pycnoporus sanguineus（L.）Murrill]又称血红栓菌，隶属担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科 （Polyporaceae） 密孔菌属（Pycnoporus）；分布于我国河南、云南、湖南、陕西、四川、新疆等省份[1]。研究表明[2-4]该菌及其菌丝体发酵提取物在医药方面有较广泛应用，如消炎、烧伤后感染的治疗、抗肿瘤等。此外，其富含多糖、黄酮等活性物质。随着食（药）用菌产业的发展，真菌多糖在功能性食品开发方面具有的潜在价值日益凸显，如提升免疫力、预防肿瘤、抗疲劳、促进伤口痊愈等[5-9]。

血红密孔菌的前期研究主要集中在培养、酶学、生态机制方面，而对其菌丝体多糖的提取及活性相关的研究尚未见报道。因此以血红密孔菌液体发酵获得的菌丝体为原材料，利用超声辅助法提取多糖成分，通过单因素、多因素试验获得最佳提取工艺条件，在最佳条件的基础上制备的菌丝体为材料进行活性研究，以为血红密孔菌菌丝体多糖的提取制备以及对深入性的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与主要设备

血红密孔菌采自平顶山市鲁山县龙潭峡景区，经组织分离获得菌种，保存于河南城建学院生命科学与工程学院菌物标本室，编号为XHMK28542。其菌丝体根据参考文献[2，10]的方法制备，放入烘箱60℃烘干至恒重，烘干后用粉碎机粉碎成粒径为小于75 μm的粉末，过筛，置于密封袋内，冻存于-20℃，备用。

芦丁标准品，北京索莱宝科技有限公司；Al（NO3）3、FeSO4·7H2O、焦性没食子酚，天津市科密欧化学试剂有限公司；NaOH、NaNO2，烟台市双双化工有限公司；其他试剂均为分析纯。

KQ-50B型超声仪，昆山市超声波仪器有限公司；JP-100A-2型紫外分光光度，上海元析仪器有限公司；PE Eenspire型酶标仪，美国PE公司。

1.2 试验方法

1.2.1 粗多糖提取

精确称取0.1 g菌丝体粉末按照料液比1∶30加入蒸馏水中，80℃热水超声辅助浸提15 min，然后使用水浴锅80℃热水提取60 min，冷却至室温，将粗多糖溶液转入离心管，加入等体积Sevage溶液 [V（氯仿）∶V（正丁醇）=5∶1]，摇匀震荡，4 000 r·min-1室温（25℃） 离心10 min，得上清。按照1∶3的体积比向上清中添加95%的乙醇并在4℃醇沉过夜，后于4 000 r·min-1室温 （25℃） 离心5 min，并将沉淀物抽滤，沉淀物用1 mL蒸馏水溶解。即得血红密孔菌菌丝体粗多糖溶液。

1.2.2 血红密孔菌菌丝体多糖提取工艺优化

单因素试验：分别评估不同的水浴温度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、超声辅助时间 （10 min、15 min、20 min、25 min、30 min） 和热水浸提时间（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min） 对菌丝体多糖提取率的影响。其除单因素优化因素外，其他粗多糖提取方法同1.2.1。

响应面试验：选取提取水浴温度、料液比、热水浸提时间、超声辅助时间4种单因素，以菌丝体多糖的提取率作为响应值。采用Box-Behnken方法优化其最佳提取条件，其他方法如1.2.1所示。

1.2.3 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[11-13]测定多糖的含量，以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，得葡萄糖标准曲线回归方程y=3.488 6x+0.006 2，相关系数R2=0.991 1，按该方程计算其粗多糖含量。吸光度值使用酶标仪测定。将样品溶液稀释10倍得到待测液，取100 μL待测液于5 mL的试管中计算多糖含量（Y，%）。其计算公式如下：

式中：C为粗多糖的含量（g·mL-1）；V为菌丝体多糖溶液的体积（mL）；N为稀释倍数；M为样品的质量（g）。

1.2.4 血红密孔菌菌丝体多糖体外抗氧化活性的测定

以相同质量浓度的VC溶液作为阳性对照，将菌丝体多糖溶液用蒸馏水配制成质量浓度分别为0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1、2.4 mg·mL-1、4.8 mg·mL-1、9.6 mg·mL-1的待测液。羟基自由基清除率的测定参照参考文献[14-16]；超氧阴离子自由基清除率的测定参照参考文献[17]。

1.2.5 血红密孔菌多糖抑菌试验

参照参考文献[18]，以青霉素为阳性对照，制备质量浓度为 0.60 mg·mL-1、1.20 mg·mL-1、2.40 mg·mL-1、4.80 mg·mL-1、9.60 mg·mL-1的菌丝体多糖溶液，过滤除菌待用。并分别培养供试菌株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）溶液。利用紫外分光光度法探究不同质量浓度菌丝体多糖对大肠杆菌等的抑菌活性，其抑菌率（I，%）的计算公式为：

式中：A0是空白对照的吸光度值；A1是样品测量管的吸光度值；Ai是样品背景管的吸光度值。

1.2.6 数据处理与分析方法

将所测得的数据通过SPSS 17.0进行统计计算，利用Design-Expert 10.0.7对响应面进行处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

单因素提取温度、料液比、热水浸提时间、超声辅助时间的试验统计结果见图1。

图1 单因素试验对多糖得率的影响Fig.1 Single factor test on the extraction rate of polysaccharides

由图1可知，在提取温度为60℃～80℃，菌丝体多糖的提取率随温度升高呈现正相关，在80℃时达到最高峰，80℃～100℃时，随着温度的升高，菌丝体多糖的提取率呈下降趋势。因此，在其他条件一定的情况下，菌丝体多糖提取的最佳温度为80℃。当料液比为1∶30时，曲线出现拐点，此时菌丝体多糖的提取率最高。热水浸提时间在20 min～40 min时，菌丝体多糖提取率呈下降趋势，而在40 min～60 min时，菌丝体多糖提取率增加，60 min时达到峰值，峰值后呈下降趋势，综合所述，60 min是菌丝体多糖热水浸提的较佳时间。超声辅助时间在15 min时达到峰值，超声辅助处理可以有效的使用超声的空穴效应破除残留的细胞壁，以利于多糖的析出。

2.2 响应面结果与分析

选取提取水浴提取温度、料液比、热水浸提时间、超声辅助时间4种单因素，以菌丝体多糖的提取率作为响应值。采用Box-Behnken方法优化其最佳提取条件，其他方法如1.2.1所示。在单因素的基础上，采用中心组和设计进行响应面试验，试验设计因素水平表见表1；试验设计以及结果见表2。采用响应面软件Design-Expert对表2的数据进行多元回归拟合并进行方差分析，得到的结果见表3。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平表Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 响应面试验设计及结果分析Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

根据表3数据获得的回归方程为：

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of variance for the fitted regression model

根据方差分析结果可得，菌丝体多糖提取工艺优化模型回归极显著（P<0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），说明了模型构建较成功，与试验的差异较小。决定系数R-Squared=0.942 2，调整决定系数=87.99%，说明该模型可以反映出87.99%的变化规律，结果表明，该模型完全符合试验数据。由F值可知，根据影响菌丝体多糖提取率的程度，对因素排序为：料液比（A） ＞热水浸提时间（D） ＞超声辅助时间（C）＞提取温度（B）。两因素交互作用对多糖产量的响应面结果图见图2。

由图2可知，各因子之间存在交互作用，响应面图的斜率越陡，相互作用越显著，斜率越小，相互作用越不显著。分析结果表明，料液比与超声辅助时间、超声辅助时间与热水浸提时间、料液比与热水浸提时间的响应面图均较陡峭。根据对响应面分析的回归方程进行数理统计分析，并结合图2两因素交互作用对多糖产量的响应面可知，4个因子之间对血红密孔菌菌丝体多糖的提取率存在最大值，对拟合出的二次多项式回归方程分别求出A、B、C和D的偏导数得出菌丝体多糖提取的最优工艺为超声辅助时间

图2 多糖产量的响应面结果图Fig.2 Response surface results plot of polysaccharide yield

15 min、热水浸提时间59 min、提取温度79.7℃、料液为1∶30，此条件预测的菌丝体多糖提取率为5.231%。经3次验证试验，可得菌丝体多糖平均实际提取率为5.228%，接近预测值，表明该模型能够准确反映各种因素对菌丝体多糖提取率的影响，结果可靠。

2.3 活性试验结果

2.3.1 抗氧化试验结果

不同质量浓度的多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除效率统计结果见图3。

图3 不同质量浓度多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率Fig.3 The scavenging rate of·OH and O2·-clearance rate by polysaccharides with different mass concentrations

如图3所示，菌丝体多糖在浓度增大的趋势下，对羟基自由基的清除率呈正相关，当质量浓度在0.021 mg·mL-1～0.035 mg·mL-1时清除率上升幅度趋于平坦，当质量浓度为0.035 mg·mL-1时，清除率达到最大值为17.80%。且菌丝体多糖浓度为0.027 mg·mL-1时对超氧阴离子自由基清除率为32.31%，在同等质量浓度下高于阳性对照。

2.3.2 抑菌试验结果

不同质量浓度的多糖抑菌效果统计见图4。

图4 不同质量浓度多糖的抑菌率Fig.4 The antibacterial ability rate of polysaccharides at different mass concentrations

由图4所示，菌丝体多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌率随着质量浓度的增加而增大，抑菌率呈现明显正相关，表明菌丝体多糖对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。在质量浓度为1.2 mg·mL-1～2.4 mg·mL-1时对绿脓杆菌的抑菌率相差不显著，后来随着浓度增加，抑菌率变化明显，在9.6 mg·mL-1时抑菌率达到最大值，表明菌丝体多糖对绿脓杆菌有明显的抑制效果。在浓度 0.6 mg·mL-1～4.8 mg·mL-1时，对大肠肝菌的抑菌率随质量浓度增加而增大，后随着质量浓度的升高，抑菌率趋于平缓，并在质量浓度最大时抑菌效果达到最大，由此可见菌丝体多糖对大肠杆菌有显著的抑制效果。对枯草芽孢杆菌的抑菌率随质量浓度增加呈现正相关，在质量浓度最高时，抑菌率达到最大值，由此可见一定质量浓度的菌丝体多糖溶液对枯草芽孢杆菌有明显的抑制效果。

3 讨论与结论

目前，基于响应面法对多糖提取工艺条件的优化已得到广泛应用[19-22]，而这种方法在对发酵获取菌丝体多糖的提取优化上也得到了较好的效果，研究结果也得到了较理想的验证。而前期的文献表明血红密孔菌含有耐高温的漆酶，可降解木材，且提取的色素可用于染料生产[23]。试验进一步拓展了血红密孔菌的新功效，对其发酵菌丝体多糖进行制备及应用于功能食品的开发提供了一定的参考数据。随着人口老龄化问题的凸显，大健康产业在全球经济中的地位逐渐提升，菌类多糖一直是功能食品开发的热点，而作为食（药）用菌种质资源创新的重要来源，对拓宽新资源具有积极的导向作用。

通过料液比、提取温度、超声辅助时间、热水浸提时间4个单因素试验，设计多因素试验得到提取血红密孔菌菌丝体多糖的最佳条件，得到在超声辅助时间为15 min、热水浸提时间为59 min、提取温度为79.7℃、料液比为1∶30；此时血红密孔菌菌丝体多糖的提取率达到5.231%。与同等浓度的VC对照组相比，菌丝体多糖对羟基自由基有一定的清除能力，但清除能力低于VC；菌丝体多糖对超氧阴离子自由基的清除能力高于对照组，说明菌丝体多糖对超氧阴离子自由基具有较好的清除能力。此外，菌丝体多糖对4种指示菌的生长有显著的抑制作用；整体来看，菌丝体多糖具有一定的抗氧化、抑菌能力，可作为一种天然的食品添加剂，在食（药）用菌天然提取物抗氧化活性方面具有良好的应用前景，该结果为食品工业应用提供了一定的理论基础。