席军强　吕娥娥　李建龙　刘文强　冯华

摘要 核桃黑斑病是由黄单孢杆菌属的核桃黄极毛杆菌（Xanthomonas campestris pv. juglandis）和链格孢菌（Alternaria alternata）复合侵染发生的病害。为控制该病害的危害，以核桃黑斑病叶分离的主要病原物链格孢菌为研究对象，采用菌丝生长速率法和培养皿玻片法，研究了不同环境条件对链格孢菌的菌丝生长及孢子萌发的影响，结果表明：链格孢菌的菌丝生长和孢子萌发的适宜温度均为25～30  ℃;全光照下利于菌丝生长，全黑暗和光暗交替可促进孢子萌发;孢子萌发的适宜pH为7～9，pH为9时最适宜菌丝的生长。

关键词 环境因素;链格孢菌;菌丝生长;孢子萌发

中图分类号：S792.13 文献标识码：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2022.04.016

Study on Biological Characteristics of Walnut Black Spot Pathogen

Xi Junqiang Lv Ee Li Jianlong Liu Wenqiang Feng Hua

（1. Guanshan Forestry Administration of Pingliang City，Pingliang 744000，Gansu;2. People's Government of Jingning Hongsi Town，Pingliang 743400，Gansu;3. People's Government of Jingning Weirong Town，Pingliang 743400，Gansu）

AbstractWalnut black spot disease is caused by the compound infection of Xanthomonas campestris pv.  juglandis and Alternaria alternata. In order to provide the theoretical basis for control the disease，the characteristics of main pathogen  A. alternata isolated from walnut leaf black spot was studied using the mycelium growth rate method and petri dish slide method to clarify the effects of different environmental conditions on pathogen mycelial growth and spore germination. The results showed that the optimum temperature for mycelial growth and spore germination was 25-30℃;full sunlight was beneficial to mycelial growth，alternating light and dark promoted spore germination;the optimum pH value for spore germination was pH7-9，the most suitable pH for mycelial growth was pH=9.

Key wordsEnvironmental factors;Alternaria alternata;mycelial growth;spore germination

核桃是我国栽培面积较为广泛的经济树种之一，栽培历史悠久，除黑龙江、上海、广东、海南外，其他各省均有栽培，栽培面积60余万hm。我国核桃产量占世界产量的27%，仅次于美国。但近年来，由于受病虫害的影响，导致核桃产量下降、品质降低，严重制约了我国核桃产业的发展。

核桃黑斑病是一种气传病害，主要危害核桃叶片和果实，该病由黄单孢杆菌属的核桃黄极毛杆菌（Xanthomonas campestris pv. juglandis）與链格孢菌共同复合侵染引起[1，2]。本文对其主要病原——链格孢菌（Alternaria alternata）的菌丝和孢子在不同环境条件下的生长和萌发状况进行了研究。链格孢菌，属半知菌纲（Imperficti）链孢霉目（Moniliales）黑霉科（Dematiaceae）链格孢属（Alternaria）。其菌落培养特征圆形，初为灰白色，后变为深灰色，菌落中间稍有隆起，背面灰黑色，外部青褐色，边缘色浅。菌丝疏松有隔，气生菌丝旺盛，较短。当链格孢菌长满培养皿后，在产孢处理下产生大量分生孢子。显微镜检下的分生孢子梗淡褐色至褐色，部分黑色，单枝，短或长，弯曲或屈膝状[3，4]，分生孢子链细长，稀疏分枝，侧枝较少。分生孢子单生或串生，形状不一，褐色，多分隔，倒梨形近卵状，也见狭棒状或倒棒状，具横隔1～5或3～7个，纵、斜隔膜0～4个[5-8]。

目前，针对链格孢菌的研究主要集中在分离与鉴定等方面[9，10]，本文就温度、光照、pH 3种环境因素对链格孢菌的菌丝生长及孢子萌发的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株及培养基供试菌株采自甘肃天水核桃黑斑病叶，通过常规组织分离法分离纯化后，保存备用。培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂12 g，蒸馏水1 000 mL，经121 ℃高温湿热灭菌20 min。

1.1.2 试验仪器与用品仪器及用品为超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、人工气候培养箱、显微镜、酒精灯、培养皿、锥形瓶、载玻片、接种针和打孔器等。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的分离与纯化采用常规组织分离法[11]分离病菌，纯化后于PDA平板培养基培养待用。

1.2.2 环境因素对链格孢菌菌丝生长的影响 采用菌丝生长速率法[11]。（1）光照对链格孢菌菌丝生长的影响研究。用直径5 mm的打孔器切取链格孢菌菌饼，呈“品”字形移接于PDA平板培养基上。光照条件分别设置为全黑暗、光暗交替（黑暗12 h，光照12 h）和全光照3个处理，每处理重复3次。每24 h十字交叉法测量菌落直径，待菌落生长边缘接连时停止测量 [11]。（2）温度对链格孢菌菌丝生长的影响研究。当活化后的供试菌株长满整个培养皿时，用直径为5 mm的打孔器切取菌饼，移接于PDA平板培养基。分别置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃共8个温度梯度下恒温培养，每处理重复3次。每24 h十字交叉法测量菌落直径，待菌落生长边缘接连时停止测量 [11]。（3）pH对链格孢菌菌丝生长的影响研究。用浓度均为1 mol·L的NaOH和HCl调节PDA培养基的pH分别为5、6、7、8、9共5个酸度处理。用直径为5 mm的打孔器切取菌饼，移接于PDA平板培养基，室温下恒温培养，每处理重复3次。每24 h十字交叉法测量菌落直径，待菌落生长边缘接连时停止测量 [11]。

1.2.3 环境因素对链格孢菌孢子萌发的影响孢子萌发采用培养皿玻片法[11]。通过对链格孢菌进行产孢处理，配置孢子悬浮液，40倍镜检，每视野下20～50个孢子。

此浓度孢子液均用于以下研究：

（1）不同光照条件对链格孢菌孢子萌发的影响。将供试孢子悬浮液分别在全光照、光暗交替（光照、黑暗每6 h交换一次）和全黑暗条件下室温恒温培养。孢子悬浮液浓度调整至40倍显微镜下每视野20～50个孢子，每次计数200个孢子以上，每处理重复3次，于36 h后观察孢子萌发个数，计算孢子萌发率[12，13]。

（2）不同温度条件对链格孢菌孢子萌发的影响。将供试孢子悬浮液浓度调整至40倍显微镜下每视野20～50个孢子，每次计数200个孢子以上，分别置于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃恒温培养箱中培养，每处理重复3次。于36 h后观察孢子萌发个数，计算孢子萌发率[12，13]。

（3）不同pH对链格孢菌孢子萌发的影响。用1 mol·L NaOH 溶液和1 mol·L HCl无菌蒸馏水溶液调节pH值，设定pH为5、6、7、8、9共5个处理，每处理重复3次。置于室温条件下培养36 h后，取各pH溶液中的孢子液镜检观察，每处理检查15个视野，每视野20～50个孢子，观察并计算孢子萌发率[12，13]。

1.3 数据统计方法

采用Excel2012对数据进行统计分析

2 结果与分析

2.1 不同环境条件对菌丝生长的影响

2.1.1 光照对链格孢菌菌丝生长的影响

由图1可知，链格孢菌在全光照、全黑暗及光暗交替下菌丝均能正常生长，在全光照下菌丝生长最好，全黑暗条件下菌丝生长速率较前2种光照处理相对较差。因此，链格孢菌在全光照条件下更适宜其菌丝生长。

2.1.2 不同温度对链格孢菌菌丝生长的影响由图2可知，在低于5 ℃或高于40 ℃下，链格孢菌菌丝不能生长，在30 ℃下菌丝生长速度最快，20～30  ℃是其菌丝生长的适宜温度。

2.1.3 不同pH对链格孢菌菌丝生长的影响由图3可知，链格孢菌菌丝在pH为5.0～9.0均可生长。pH为8～9适宜菌丝生长，在pH为9.0处理下菌丝生长速度最快，菌落直径最大。

2.2 光照、温度、pH对孢子萌发的影响

2.2.1 不同光照对链格孢菌孢子萌发的影响由图4可知，链格孢菌在全光照、光暗交替、全黑暗3 种光照处理下，其孢子均能萌发;在全黑暗和光暗交替条件下链格孢菌的孢子萌发率均较高，且差异不显著;全光照下的孢子萌发相对较差。

2.2.2 不同温度对链格孢菌孢子萌发的影响由图5可知，链格孢菌在5～40  ℃温度条件下孢子均能萌发，其孢子萌发适宜温度为20～30  ℃。最适萌发温度为25  ℃，当温度低于10  ℃或高于35  ℃时，孢子萌发率急剧下降。

2.2.3 不同pH对链格孢菌孢子萌发的影响由图6可知，在pH为5～9时链格孢菌的孢子均能萌发，且萌发率均在80%以上，pH为9的处理孢子萌发率最高，达92.96%，是链格孢菌的最适孢子萌发酸碱度环境。pH为7～9是孢子萌发的适宜酸度范围，且偏碱性环境更有利于其孢子的萌发，随着pH的降低，其孢子萌发率减小。

3 结论与讨论

链格孢菌在全光照条件下较全黑暗与光暗交替，更适宜其菌丝生长;而孢子萌发的最适光照条件与菌丝生长所需的最适光照条件则相反，其孢子萌发在全黑暗和光暗交替条件下，孢子萌发率较高，全光照条件下不利于其孢子萌发。孢子萌发的温度范围较菌丝生长温度范围更为宽泛，在5～40 ℃下孢子均可萌发，而当温度超过35 ℃或低于5 ℃时，菌丝则生长停止。其孢子萌发的最适温度范围与菌丝最适生长温度范围相一致，均在25～30 ℃。在偏碱性条件下，更有利于链格孢菌的菌丝生长与孢子萌发，且随pH的降低，其孢子萌发率下降。这与葛妍等[14]的研究结果相一致。

本研究以核桃病变叶片分离链格孢菌为研究对象，初步摸清环境因素对链格孢菌菌丝生长和孢子萌发的影响。了解链格孢菌的生物学特性可为病害防治提供理论依据，以减轻该病对核桃的枝、叶、花和果实的危害，提高核桃产量及品质。

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