王彪，赵杨，仇杰

(贵州大学 林学院 贵州省森林资源与环境研究中心， 贵州 贵阳 550025)

花粉是高等植物的雄配子体，在双受精中起到传递父本基因的作用，了解植物花粉粒的形态在植物分类和花粉萌发能力方面具有积极的参考意义。花粉形态可用于研究植物分类，并已在秋海棠属(Begonia)[1]、黄精属(Polygonatum)[2]、杨梅属(Maesa)[3]和蔷薇属月季组(R.sect.chinenses)[4]等的植物分类中得到利用。花粉的形态与花粉萌发能力显著相关，萌发的花粉粒显著大于未萌发的花粉粒[5-6]。正常发育的花粉虽然有轻微的凹陷，但整体饱满，形状规则，只有极个别花粉较瘪；而败育的花粉粒则基本呈皱扁三角形、瘪三角形或不规则畸形[6]。因此，了解花粉粒的形态对于研究花粉离体萌发具有重要的意义。

杂交是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物新品种选育的主要手段，杂交育种的成功率与花粉活力的高低密切相关，选择花粉活力高的品种作为父本，才能得到更多的杂交后代。现在，花粉活力检测的方法有很多，常用的主要有TTC染色法、I2-KI染色法、醋酸洋红染色法、过氧化物酶染色法，但染色法在实际运用中得到的结果与实际的结果有较大的偏差，而花粉离体萌发则更加接近于实际的结果，因此花粉离体萌发被认为是检测花粉活力最可靠的方法[7]。在合适的温度下，适宜的培养基组分能够更好地促进花粉体外萌发。有关研究表明蔗糖、硼酸在花粉离体培养时对于花粉萌发和花粉管生长具有显著的促进作用[8-9]。生长调节剂GA3、IAA和NAA也会影响花粉萌发和花粉管生长[10-12]。

七姊妹蔷薇(RosamultifloraThunb.var.carneaThory)是蔷薇科蔷薇属野蔷薇(RosamultifloraThunb)的一个变种，重瓣花，粉红色，花朵硕大，一枝七花或十花，具有很高的园林观赏价值，广泛用于城市道路、公园和庭院等绿化，深受人们喜爱。七姊妹蔷薇具有较强的耐热性[13]，是蔷薇属优良的耐热种质资源，也是培育蔷薇耐热品种的优良材料来源。对于七姊妹蔷薇花粉萌发，已有研究表明10%蔗糖适宜七姊妹蔷薇花粉的萌发，萌发率达84.2%[14]。但对于硼酸、蔗糖和植物生长调节剂对七姊妹蔷薇花粉萌发和花粉管生长的影响还未见报道。因此，本研究以七姊妹蔷薇新鲜花粉为试验材料，观察花粉形态，探究蔗糖、硼酸、IAA、NAA和GA3对其花粉离体萌发的影响，以期为七姊妹蔷薇花粉的活力检测、杂交育种等研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用贵州大学校园内的七姊妹蔷薇花粉作为试验的材料。参试七姊妹蔷薇植株常规管理。于2021年5月17日选择10株正常开花的健康成年植株，在其花朵开放当天每株取6个花苞，共60个花苞。其中，30个花苞取出花药待其自然散粉备用，另外的花苞放入4 ℃的冰箱中保存，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉形态观察

将新鲜花粉轻撒在样品台上后放置在离子溅射仪(MSP-mini)喷金10 s，在扫描电子显微镜(Hitachi TM4000 plus)下观察拍照。选取3个视野，每个视野花粉数大于30，观察花粉的外部形态，对每个视野中圆满花粉和干瘪花粉分别计数，计算圆满花粉和干瘪花粉分别占视野内总花粉的比例，计算平均值；测量所选视野中所有花粉的纵轴长与横轴长，计算花粉的平均纵轴长与横轴长。

1.2.2 试验设置

选用1%的琼脂为培养基固化剂，设置4种蔗糖浓度梯度(50、 100、150、200 g/L)与3种硼酸浓度梯度(50、100 、150 mg/L)，采用完全随机设计的二因素试验讨论蔗糖和硼酸2种因子对花粉萌发的影响情况，从其中选出七姊妹蔷薇花粉萌发情况最佳的培养基作为基本的培养基。

在基本培养基中添加不同浓度(0.5、1、5、10、20 mg/L)的萘乙酸(NAA)、不同浓度(1、5、10、20、40 mg/L)的吲哚乙酸(IAA)以及不同浓度(20、40、60、80、100 mg/L)的赤霉素(GA3)，对照为不添加植物生长调节剂，讨论每种植物生长调节剂对七姊妹蔷薇花粉萌发的影响。

1.2.3 花粉培养

将配置好的液态培养基加热，迅速吸取液态培养基，滴在载玻片上，轻轻摇晃形成厚度均匀的液体薄层。待温度适宜以后用毛笔蘸取少量的花粉均匀地弹拨于培养基中。将培养基放入带有湿润滤纸的培养皿，随后放入温度已经恒定的25 ℃培养箱中进行培养，蔗糖和硼酸双因素试验培养4 h，植物生长调节剂试验培养2 h。

1.2.4 花粉萌发率及花粉长度的测量

取出培养基，用纸巾擦去培养皿底部的水分，以免影响观察时的清晰度。使用显微镜统计花粉萌发率和花粉管长度。在蔗糖和硼酸对花粉萌发影响的双因素试验中选取5个视野的花粉总数和萌发数计算萌发率，在萘乙酸(NAA)、生长素(IAA)、赤霉素(GA3)对七姊妹蔷薇花粉萌发影响的单因素试验中选择3个视野的花粉总数和萌发数计算萌发率，花粉管长度超过1/2花粉直径者视为萌发；选择3个不同的视野，每个视野随机选择5条花粉管测量花粉管长度，计算花粉管长度。

花粉管长度(μm)=测量的所有花粉管长度(μm)/测量的花粉粒数

花粉萌发率(%)=(视野内萌发的花粉个数/视野内观察的花粉总数)×100%

1.3 数据分析

数据用Excel 2010进行统计，使用R(R 4.0.4)语言aov函数进行方差分析、Duncan法进行多重比较和ggplot函数进行图形制作，使用Adobe Photoshop(Illustrator CC)对图形进行细微调整。

2 结果与分析

2.1 花粉外部形态

如图1，七姊妹蔷薇的花粉具有3个萌发沟，萌发沟的两端基本到达两极。平均极轴长(P)47.0 μm，平均赤道轴长(E)22.5 μm，为超长球形(P/E>2)。发育良好的花粉其表面光滑，形状饱满，为易于萌发的花粉。而发育不好的花粉则表现为干瘪，萌发沟深而宽，形状扭曲并且花粉较小，花粉萌发就较为困难。七姊妹蔷薇93.2%的花粉光滑饱满，仅有6.8%的花粉扭曲干瘪。

图1 花粉电子显微镜扫描图

2.2 蔗糖和硼酸对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长的影响

经过方差分析发现，在培养基中加入蔗糖对七姊妹蔷薇的花粉萌发(图2A)及花粉管生长(图2B)均有极显著的影响；加入硼酸对花粉萌发有显著的影响，对花粉管生长影响不显著。在蔗糖浓度为50、100和200 g/L时随硼酸浓度的增加花粉萌发率降低，但在蔗糖浓度为150 g/L的情况下，花粉萌发率随硼酸浓度的增加而增加，蔗糖与硼酸的交互作用对七姊妹蔷薇的花粉萌发和花粉管生长均具有极显著的影响。七姊妹蔷薇花粉萌发率随蔗糖浓度的增加先增加后降低，在蔗糖质量浓度为150 g/L和硼酸质量浓度为150 mg/L的培养基中七姊妹蔷薇的花粉萌发率最高，达到72%。在蔗糖和硼酸对七姊妹蔷薇花粉管生长影响的所有试验处理中，有3个处理(蔗糖150 g/L+硼酸150 mg/L、蔗糖200 g/L+硼酸50 mg/L、蔗糖200 g/L+硼酸150 mg/L)显著高于其他处理，花粉管长度分别达到838.7 、722.9和656.7 μm。综上所述，在该试验所设置的试验处理中蔗糖150 g/L+硼酸150 mg/L对七姊妹蔷薇花粉萌发和花粉管生长效果最佳。

图2 蔗糖和硼酸对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长的影响

2.3 植物生长调节剂对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长的影响

2.3.1 萘乙酸对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长的影响

萘乙酸(NAA)不是七姊妹蔷薇花粉体外萌发的必需物质，七姊妹蔷薇花粉在不含NAA的培养基中依然能够萌发(萌发率为44%)，但是NAA浓度对花粉萌发有显著影响(图3A)。在NAA浓度为0 ～10 mg/L时，花粉萌发率随NAA浓度的增加而增加；在浓度为1 ～10 mg/L时，花粉萌发率均高于CK，且在此浓度区间花粉萌发率与CK存在显著差异(P<0.05)；在NAA浓度为10 mg/L时，花粉萌发率最高，为57%；NAA浓度在20 mg/L时，花粉萌发率显著(P<0.05)低于对照组，萌发率仅为19%。NAA也会影响花粉管生长的速度(图3B)，添加1 mg/L和5 mg/L的NAA，花粉管的生长长度增加，但是不显著(P>0.05)；在NAA浓度在5 ～20 mg/L时花粉管长度随NAA浓度的增加而下降，且在此浓度区间花粉管长度存在显著差异(P<0.05)；NAA浓度在20 mg/L时，花粉管长度仅为149.9 μm，显著低于对照组(P<0.05)。综上所述，NAA浓度为10 mg/L时花粉萌发率达到最高，NAA对于花粉管生长没有显著促进作用且高浓度(20 mg/L)时反而起到抑制作用。

图3 NAA对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长的影响

2.3.2 生长素对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长的影响

生长素(IAA)不是七姊妹蔷薇花粉体外萌发的必需物质，七姊妹蔷薇花粉在不含IAA的培养基中依然能够萌发(萌发率为44%)，但是IAA浓度对花粉萌发有显著影响(图4A)。在IAA浓度为0～1 mg/L时，花粉萌发率随NAA浓度的增加而增加；在浓度为1 mg/L时，花粉萌发率显著高于CK(P<0.05)，达到48%；在IAA浓度为1～40 mg/L时，花粉萌发率随IAA浓度的升高而降低，且在浓度为20 mg/L时花粉萌发率显著低于对照组(P<0.05)，为19%；添加40 mg/L的IAA时，花粉完全没有萌发，抑制效果显著。在本试验所设置的IAA浓度梯度(1、5、10、20、40 mg/L)下，IAA对花粉管生长无显著促进作用，且高浓度(40 mg/L)时反而起到强烈的抑制作用(图4B)。综上所诉，适合七姊妹蔷薇花粉萌发的IAA浓度为1 mg/L。

图4 IAA对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长的影响

2.3.3 赤霉素对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长的影响

赤霉素(GA3)不是七姊妹蔷薇花粉体外萌发的必需物质，七姊妹蔷薇花粉在不含GA3的培养基中依然能够萌发(萌发率为44%)，但是GA3浓度对其花粉萌发有显著影响(图5A)。在GA3浓度为0 ～60 mg/L时，花粉萌发率随GA3浓度的增加而增加；在浓度为60 mg/L时，花粉萌发率显著高于CK，达到64%；在GA3浓度为60～100 mg/L时，花粉萌发率随GA3浓度的升高而降低，且在浓度为100 mg/L时花粉萌发率显著低于对照组，仅为28%。在本试验所设置的GA3浓度梯度(20、40、60、80、100 mg/L)下，GA3对花粉管生长无显著促进作用(图5B)。综上所诉，适合七姊妹蔷薇花粉萌发的GA3浓度为60 mg/L。

图5 GA3对七姊妹蔷薇花粉萌发和花粉管生长的影响

3 讨论与结论

每种花粉的形态及结构都有差别，其大小、形状、萌发孔和花粉表面的花纹是研究植物分类的重要依据[15]。花粉的形态对于研究花粉的萌发有一定的指示作用，通常表现为发育异常的花粉，其花粉小、扭曲和干瘪等。本试验观察了七姊妹蔷薇花粉，发现90%以上的花粉形态光滑饱满，具有较好的萌发基础。

蔗糖是花粉萌发所需的重要物质，在花粉的萌发过程中起到提供能量和调节渗透压的作用。蔗糖浓度显著影响花粉萌发和花粉管生长，这在油茶(Camelliaoleifera)[16-17]、白花栝楼(TrichosanthesdioicaRoxb.)[18]、桃(AmygdaluspersicaL.)[19]等植物中已经得到验证。蔗糖对花粉萌发的影响表现为低浓度促进，高浓度抑制，本试验也得出相同的结果。硼在植物体中分布不均，以花中分布最多。在本试验中发现硼酸对于七姊妹蔷薇花粉的萌发具有显著影响，在大岩桐(Sinningiaspeciosa)花粉的研究中也得出相同的结论[20]，但硼酸对七姊妹蔷薇花粉管的生长影响不显著，与大岩桐花粉的研究中的结果并不相同，并且发现蔗糖与硼酸的交互作用对七姊妹蔷薇花粉萌发及花粉管生长有显著的影响，其萌发率和花粉管长度在150 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸时最高。表明七姊妹蔷薇花粉萌发的过程中，硼酸的作用主要是协助蔗糖发挥作用。这可能是由于硼离子能与蔗糖形成络合物，使糖易于通过质膜在组织中传输，从而促进了糖的吸收与代谢。

植物生长调节剂是人工合成的具有和植物内源激素功能相似的物质，能调控植物体内物质代谢和生理功能。以往的研究中发现植物生长调节剂对花粉的萌发及花粉管生长具有一定的影响，如：对早黑宝葡萄(Vitisvinifera)[21]和黄刺玫(Rosaxanthina)[12]的研究表明低浓度的萘乙酸对花粉萌发有促进作用，当浓度增大时，抑制效果突出；杨谷良等[22]研究发现，萘乙酸对黄金梨(Pyruspyrifolia)花粉管的生长表现出抑制作用。本研究与前人的研究结果相似，低浓度的萘乙酸促进七姊妹蔷薇花粉萌发，高浓度的萘乙酸抑制其的花粉萌发。

赤霉素对对花朵具有重要的意义，其不仅能作为开花抑制剂[23]，更能作为花粉萌发促进剂。研究表明，过高和过低的赤霉素都不利于枣(ZizyphusjujubaMill．)花粉的萌发和花粉管的生长，10 mg/L的赤霉素对枣花粉萌发的促进作用最显著，1.0 mg/L的赤霉素对枣花粉管生长的促进作用最显著[24]；新疆‘晚丰’巴旦木(Prunusdulcis‘Wanfeng’)花粉萌发和花粉管生长的最适赤霉素浓度为0.001 5%[25]；榆叶梅(Prunustriloba)花粉萌发和花粉管生长的最适赤霉素浓度为25.0～100.0 mg/L[26]。在本试验中发现60 mg/L的赤霉素最适合七姊妹蔷薇花粉的萌发，与榆叶梅花粉萌发最适浓度有重合。但在赤霉素浓度为100 mg/L时七姊妹蔷薇的花粉萌发明显受到抑制作用，而在榆叶梅花中则是最适的浓度范围，并且赤霉素不能显著促进七姊妹蔷薇花粉管的生长，但在枣和榆叶梅花中则能显著地促进其花粉管生长。总而言之，赤霉素对不同花粉萌发的作用并不相同，但都表现出低促高抑的大致规律。

吲哚乙酸对不同植物花粉萌发和花粉管生长的影响结果不同。如：孙慧瑛等[27]和杨晓梅等[28]对不同植物花粉的研究表明，吲哚乙酸在低浓度条件下促进花粉萌发和花粉管生长,高浓度下则有抑制作用；吲哚乙酸对‘秦冠’苹果(MaluspumilaMill.)花粉管生长没有明显的促进作用，随吲哚乙酸浓度的增大其抑制效果更加显著[29]。在本试验中吲哚乙酸浓度为1 mg/L时最适合七姊妹蔷薇花粉萌发，吲哚乙酸对七姊妹蔷薇花粉萌发具有低浓度促进，高浓度抑制的效果。吲哚乙酸对七姊妹蔷薇花粉管生长无显著影响。

本试验观察了七姊妹蔷薇花粉的形态，研究了蔗糖与硼酸双因素对花粉萌发及花粉管生长的影响，得出如下结论：硼酸、蔗糖、萘乙酸、赤霉素和吲哚乙酸能促进七姊妹蔷薇花粉萌发和花粉管生长，其最佳浓度分别为150 mg/L、150 g/L、10 mg/L、60 mg/L、1 mg/L。蔗糖和硼酸的交互作用对七姊妹蔷薇花粉萌发和花粉管生长作用显著，但其余因子之间是否具有交互作用还需进一步研究。这些结果可为七姊妹蔷薇花粉活力检测和以七姊妹蔷薇作为父本杂交提供参考。