李许涛，武广鹏，李伟观，周硕野，田效园

（河南省烟草公司，河南 郑州 450018）

氮素是植物生长发育必需的重要营养元素，对植物的物质代谢、生化过程以及产品品质等都具有重要的影响。在烟草中，氮代谢相关酶［硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脱氢酶（GDH）等］的活性可以直接反映烟草对氮素同化和吸收的水平［1］。周健飞等［2］的研究表明增加施氮量可使GS活性峰值推迟，且不同品种的GS活性不同。张生杰等［3］的研究表明在不同基因型烤烟间的烟叶NR活性均达到极显著差异，与刘卫群等［4］的研究结果相近。不同氮效率的烤烟品种的GDH活性不同，氮高效品种的GDH活性较低，增加氮用量不利于烤烟的成熟落黄［5］。同时氮代谢也会对烟叶的次生代谢产生影响，类胡萝卜素和酚类化合物是烟株的主要次生代谢产物，亦是烟叶的重要香气前体物质［6-8］。刘春梅等［9］的研究表明类胡萝卜素含量在不同基因型、氮用量处理间存在差异。酚类化合物总量在不同的烟草中有显著差异［10］，其调制后的降解产物能起到增加香气量、改善余味的作用。

此外，氮肥施用量对烤烟烟叶的成熟采烤和烟叶的产量和质量均有重大的影响［11-12］。多酚在烟草的调制特性、色泽、等级，以及烟气香味等各个方面起着重要作用，是衡量烟草品质的一个重要因素，因而在提高烟叶品质的研究中，多酚类物质是不容忽视的［15］。在烘烤前期烟叶的变黄必须在一定含水量的条件下进行，黄色的固定又必须通过失水干燥来实现［13］。多酚氧化酶的活性与烤烟品种的烘烤特性存在着极为密切的关系，且不同品种的多酚氧化酶活性与烤后杂色烟比例呈显著正相关，在定色期多酚氧化酶的活性对烟叶的耐烤性有重要的影响［14］。目前，对云烟87、NC71氮代谢和烘烤特性的研究报道较多［16-17］，但不同氮用量对烤烟品种氮代谢及烘烤特性影响的研究报道较少。因此，笔者以南阳烟区的云烟87、NC71为试验材料，研究了在不同氮用量条件下烤烟氮代谢及次生代谢的差异，揭示了烤烟部分香气前体物质形成与氮代谢过程的内在联系，并且探讨了在烘烤过程中水分含量和多酚氧化酶活性的变化，以期为不同烤烟品种选择适宜的氮用量提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

供试烤烟品种为NC71、云烟87。取烟株中部叶（从底部向上数第12～14片）进行相关指标的测定。各试验处理设置5次重复。

氮代谢特性、烘烤特性试验于2018～2019年在南阳市方城县金叶园进行。供试地土壤类型为黄壤土，土壤pH值为7.48，有机质含量为11.45 g/kg，碱解氮含量为55.00 mg/kg，速效磷含量为15.01 mg/kg，速效钾含量为135.00 mg/kg。烤烟分别于2018年4月28日、2019年5月3日移栽。

氮代谢特性试验采取裂区设计，其中品种为主区，施氮量为副区。施氮量设置低氮N1（30 kg/hm2）、中 氮 N2（45 kg/hm2）、高 氮N3（60 kg/hm2）3 个处理；于移栽后110 d取样。烘烤特性试验依据不同施氮量设置3个处理，在采收后按照常规三段式烘烤工艺进行烘烤，在烘烤过程中的第0、24、48、60、72、96、120 h取样。烤烟种植行距120 cm，株距55 cm；其他田间管理措施按当地优质烟生产要求。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 酶活性的测定 使用北京索莱宝科技有限公司提供的试剂盒测定硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、多酚氧化酶（PPO）的活性。

1.2.2 其他生理指标的测定 游离氨基酸含量采用茚三酮显色法测定；类胡萝卜素含量采用96%乙醇浸提法测定；烟碱含量采用乙酸萃取法测定；总酚含量采用福林酚法测定；含水量采用《YC/T 311─2009 烤烟品种烘烤特性评价》中的方法测定。

1.2.3 外观质量的评价 根据《GB 2635─1992烤烟》中的标准，由河南中烟公司的专家对烤后烟叶的颜色、成熟度、身份、油分、色度、叶面组织特征、柔韧性、光泽度等外观质量指标进行评价。

1.3 数据分析

采用Excel 2010、SPSS 20.0统计分析软件对试验数据进行统计分析、曲线拟合和方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同氮用量对烤烟氮代谢酶活性的影响

由表1可知：NR、GOGAT酶活性在品种间整体表现为云烟87＞NC71；GDH、GS酶活性表现为NC71＞云烟87。这说明云烟87品种烟叶在成熟期NR、GOGAT的活性较高，GDH、GS的活性较低，而NC71则相反。

表1 在不同氮用量条件下烤烟氮代谢关键酶活性的比较

在不同施氮量处理间氮代谢关键酶的活性也存在着一定的差异。NR、GS、GOGAT的活性随施氮量的增加而升高，低氮处理的NR、GS和GOGAT的活性显著低于中氮、高氮处理。在NC71中GDH的活性随施氮量的增加而升高，在高氮处理下有最大值；而在云烟87中GDH的活性随施氮量的增加先增加后降低，在中氮处理下有最大值。这说明GDH活性存在着品种与氮用量互作现象。

NC71在高氮处理下的NR活性与云烟87在中氮处理下的NR活性差异不显著；NC71在高氮处理下的GOGAT活性也与云烟87在中氮处理下的GOGAT活性差异不显著，这表明NC71的氮同化和吸收能力较云烟87弱。

2.2 不同氮用量对烤烟次生代谢的影响

由表2可以看出：游离氨基酸、烟碱和类胡萝卜素含量在不同烤烟品种间整体表现为云烟87＞NC71；总酚含量在2个品种间也存在着差异，整体表现为NC71＞云烟105，这说明云烟87在烟叶成熟期的游离氨基酸、类胡萝卜素、烟碱含量高于NC71。

表2 在不同氮用量条件下烤烟氮代谢及次生代谢产物含量的比较

在不同施氮量处理间氮代谢及次生代谢产物含量也存在一定的差异，其中游离氨基酸、烟碱含量随施氮量的增加而增加；云烟87的类胡萝卜素含量随施氮量的增加而增加，在高氮处理下有最大值；NC71的类胡萝卜素含量随施氮量的增加而先增加后降低，在中氮处理下有最大值；NC71的总酚含量随施氮量的增加而增加，在高氮处理下有最大值；云烟87的总酚含量随施氮量的增加而先增加后降低，在中氮处理下有最大值。这说明类胡萝卜素、总酚的含量存在着品种与氮用量互作现象。

NC71在高氮处理下的游离氨基酸含量与云烟87在中氮处理下的游离氨基酸含量差异不显著；NC71在高氮处理下的烟碱、类胡萝卜素含量均显著低于云烟87在中氮处理下的，这说明NC71的烟株需要在高氮处理下才能进行较好的次生代谢，而云烟87的烟株在中氮处理下就可以进行较好的次生代谢。

2.3 不同氮用量对烘烤过程中烟叶含水量的影响

由图1a和图1b可以看出，在烤烟烘烤过程中烟叶含水量呈“”型曲线下降，不同品种及施氮量处理烟叶含水量的变化趋势一致，均随着烘烤时间的增加而呈下降趋势。云烟87在48 h（定色期）前含水量下降较平缓，在48 h后含水量下降明显加快，且不同施氮量处理的烟叶含水量均表现为N1＞N3＞N2。NC71在24 h（定色期）前含水量下降较平缓，在24 h后含水量下降明显加快，且不同施氮量处理的烟叶含水量均表现为N3=N2＞N1。

根据不同品种及不同施氮量处理烟叶在烘烤过程中含水量的变化曲线（图1），利用回归方程y=ax3+bx2+cx+d对曲线进行拟合，其中，y为烟叶含水量（%）；x为烘烤时间（h）；a、b、c、d为待定参数（表3）。所建立的回归方程经F测验，P值均小于0.0001，达极显著水平，即拟合方程具有统计学意义。

表3 不同品种在烘烤过程中烟叶含水量变化的拟合特征参数

进一步求所建方程中时间的二阶导数，可以计算出不同品种烟叶在烘烤过程中的失水速率。由图1c和图1d可以看出，不同品种及不同施氮量处理烟叶的失水速率均随烘烤时间的增加而呈上升趋势。云烟87的烟叶失水速率在中氮处理下最大，在低氮处理下次之，在高氮处理下最小。NC71的烟叶失水速率在高氮处理下最大，在中氮处理下次之，在低氮处理下最小。这表明不同品种在不同施氮量条件下烟叶的失水速率不同。

图1 在不同氮用量条件下烤烟含水量和失水速率的变化（2年平均值）

2.4 不同氮用量对烘烤过程中烟叶PPO活性的影响

由图2a、图2b可以看出：云烟87在烘烤过程中烟叶的PPO活性呈“W”型曲线变化，NC71在烘烤过程中烟叶的PPO活性呈镜像“N”型曲线变化；这2个品种的烟叶PPO活性均在烘烤时间0～24、72 h时出现高点，在48、96～120 h时出现低点，但云烟87在96～120 h出现低点后又有所增加。云烟87的烟叶PPO活性在中氮处理下最低，在高氮处理下次之，在低氮处理下最高。NC71的烟叶PPO活性在高氮处理下最低，在中氮处理下次之，在低氮处理下最高。

利用方程y=ax5+bx4+cx3+dx2+ex+f对图2a、图2b中的曲线进行拟合，其中，y为烟叶的PPO活性［U/（g·min）］；x为烘烤时间（h）；a、b、c、d、e、f为待定参数（表4）。对所建立的各个回归方程进行F测验，结果P值均小于0.0001，达极显著水平，即拟合方程具有统计学意义。

表4 不同品种在烘烤过程中烟叶PPO活性变化的拟合特征参数

进一步求上述拟合方程中时间的二阶导数，可以计算出不同品种烟叶PPO的积累速率。从图2c、图2d可以看出，不同品种及施氮量处理烟叶PPO的积累速率均随着烘烤时间的增加而呈上升趋势。云烟87在中氮处理下PPO积累速率最慢，NC71在高氮处理下PPO积累速率最慢。这表明不同品种在不同施氮量条件下烟叶PPO的积累速率不同。

图2 在不同氮用量条件下烟叶PPO活性和积累速率的变化（2年平均值）

2.5 不同氮用量对烘烤过程中烟叶总酚含量的影响

由图3a、图3b可以看出，不同品种及不同施氮量处理烟叶的总酚含量在烘烤过程中均呈“N”型曲线变化，在烘烤时间0～48 h期间上升，之后缓慢下降，在72 h后再次上升并达到最高值。适宜的施氮量能够有效地提高烟叶总酚的含量，云烟87在中氮处理下烟叶总酚含量最高；NC71在高氮处理下烟叶总酚含量最高。

利用方程y=ax5+bx4+cx3+dx2+ex+f对图3a、图3b中的曲线进行拟合，其中，y为烟叶的总酚含量（mg/g）；x为烘烤时间（h）；a、b、c、d、e、f为待定参数（表5）。对所建立的回归方程进行F测验，结果各方程的P值均小于0.0001，达极显著水平，即拟合方程具有统计学意义.

表5 不同品种在烘烤过程中烟叶总酚含量变化的拟合特征参数

进一步求上述方程中时间的二阶导数，可以计算出不同品种烟叶的总酚氧化速率。由图3c、图3d可以看出，不同品种及不同施氮量处理烟叶的总酚氧化速率均随着烘烤时间的增加而呈上升趋势。在不同施氮量处理下云烟87烟叶的总酚氧化速率表现为N1＞N2=N3，而NC71的总酚氧化速率表现为N2＞N1＞N3。这表明不同品种在不同施氮量条件下烟叶的总酚氧化速率不同。

图3 在不同氮用量条件下烟叶总酚含量和氧化速率的变化（2年平均值）

2.6 不同氮用量对烤后烟叶外观质量的影响

由表6可知：烤烟外观质量各项指标的评价得分在不同品种间整体差异不显著，但在不同施氮量处理间存在着一定的差异；NC71在高氮处理下烤烟外观质量各项指标的评价得分与云烟87在中氮处理下的差异不显著，且显著高于其他处理。

表6 不同施氮量处理对烤烟外观质量评价得分的影响

3 讨论与结论

烤烟吸收的氮素以硝态氮为主。本试验结果表明，随着施氮量的增加，硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）的活性均提高，这与岳红宾［18］、高琴［19］等的研究结果相同，表明烤烟植株吸收、同化、再同化氮素的能力与施氮水平呈正相关。本试验在烟叶成熟期取样，谷氨酸脱氢酶（GDH）表现为脱氨作用，这与前人［20-21］的研究结果一致。在不同烤烟品种间氮代谢的特性差异较大［22］，烟株叶片中的氮代谢产物含量也可以在一定程度上反映不同品种氮吸收、同化的差异。云烟87在成熟期的NR、GOGAT活性较高，GDH活性较低，表明其吸收、同化氮素的能力较强。NC71在成熟期的NR、GOGAT活性较弱，GDH活性较强，表明其吸收、再同化氮素的能力弱，氮素营养物质的降解量较大，此研究结果与周健飞等［23］的研究结果相同。本研究还发现：烤烟中游离氨基酸、烟碱等氮代谢产物的含量亦随着施氮水平的提高而增加［23-24］；总酚含量在不同品种间存在差异，总体表现为NC71＞云烟87；NC71的总酚含量随着施氮量的增加而增加，云烟87的总酚含量则随着施氮量的增加而先增加后减少；不同品种烟叶的类胡萝卜素含量总体表现为云烟87＞NC71，进一步说明NC71在成熟期吸收、再同化氮素的能力弱；高氮（施氮60 kg/hm2）处理有利于烤烟氮代谢及其次生代谢物的积累，从而有助于烤烟部分香气前体物质的形成和烟叶落黄，进而可以改善烟叶的香气质量，提高烟叶的产量和品质。

目前，烘烤特性多以易烤性和耐烤性来评价，烤烟品种的烘烤特性与烘烤质量及烘烤工艺密切相关，制定适于不同品种的烘烤方法是提高烟叶质量的前提［25］。不同烤烟品种具有不同的烘烤特性［26］。在实际生产中，烟农对新品种的烘烤特性认识不够，容易烤坏烟叶。王传义［27］用失水性、叶绿素降低速率和多酚氧化酶活性来综合评价品种的烘烤特性。在烘烤过程中，烟叶的失水特性和变黄特性直接反映了易烤性。烟叶在变黄和定色期间对环境温湿度的忍耐性反映了耐烤性［28］。本研究结果表明：云烟87在中氮条件下、NC71在高氮条件下的变黄与失水较为协调，表现出较好的易烤性。多酚氧化酶活性高的品种，在定色期间多酚类物质容易发生酶促棕色化反应，造成烤后杂色烟的比例较大［29］。在本试验中，各品种的PPO活性在定色期有明显的高峰，这与兰俊荣等［30］的研究结果一致。这可能是由于在烘烤过程中烟叶水分不断流失，烟叶细胞裂解较快，导致细胞完整性被破坏［31］。从本研究定色期（72 h）的结果来看，云烟87在中氮条件下、NC71在高氮条件下多酚氧化酶的积累速率增加较缓慢，烤后烟品质较好，耐烤性较好。