陈勇高，吴少梅，易 冰

(中山市人民医院a.输血科；b.分子诊断中心，广东中山 528400)

关键字：RhD阴性；D变异体；弱D表型；部分D表型；Del表型

Rh血型系统，是人类红细胞血型中最复杂最具遗传多态性的一个系统，也是输血医学中除ABO血型外最为重要的血型系统。目前已发现50多种Rh抗原，其中RhD抗原的免疫原性最强，因其常常引起溶血性输血反应、新生儿溶血病（hemolytic disease of the newborn，HDN）和自身免疫性溶血性贫血等而备受重视。RHD基因容易发生变异，会产生一系列具有RhD阴性特征且易与 RhD阴性血型相混淆的D变异体（部分D、弱D和Del型）[1]。本研究通过血清学结合分子生物学方法对中山地区RhD变异型及其发生的分子机制进行探究，为指导本地区临床输血和育龄妇女采取恰当的预防新生儿溶血病措施提供更准确的检测结果和科学依据，对输血安全和稀有血型的合理应用都具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究选取了2017年12月～2019年2月中山市人民医院门诊和住院的本地患者24 286例。平均年龄40.56±20.61岁，基本覆盖了本地区不同年龄阶段的人群。

1.2 试剂与仪器 主要试剂：ABO-RH血型检测卡（微柱凝胶法）、抗人球蛋白检测卡(IgG+C3d)均购自北京斑珀斯科贸有限责任公司；单克隆抗D (IgM+IgG) 购自英国密理博公司；单克隆抗D（IgM），单克隆抗D（IgG），单克隆抗C, c, E, e（IgM）血型定型试剂购自上海血液生物医药有限公司；红细胞IgG抗体释放剂（酸放散法）购自广州展全生物科技有限公司；基因组DNA提取试剂盒、人类红细胞RhD基因分型检测试剂盒（PCRSSP法）购自天津秀鹏生物技术开发有限公司。所有试剂均在有效期内使用，且严格按照说明书操作。常用仪器为Baso2005-2离心机，恒温箱等。

1.3 方法

1.3.1 RhD阴性筛查：采用ABO-Rh微柱凝胶血型卡对本院门诊及住院病人的血液样本进行ABO血型的鉴定和RhD阴性筛选。同时，以IgM抗-E,e, C, c分型试剂对初检后阴性样本进行表型鉴定。

1.3.2 RhD变异体血清学确认试验：使用IgM,IgG和IgM+IgG抗-D单克隆抗体，通过间接抗人球蛋白技术（indirect antiglobulin test, IAT），对上述筛选出的RhD阴性样本进行确认，有1种或1种以上抗体示抗-D阳性，判定为D变异（弱D或部分D）。随后进行吸收放散试验对IAT法确认后的RhD阴性样本进行Del表型鉴定，步骤为：将1ml在正常离子强度盐水中洗涤过的红细胞与等体积单克隆IgG抗-D混合液混合在试管中，置于37℃环境下孵育1h后使用酸放散液检测Del型。

1.3.3 RHD基因分型检测和1～10外显子测序：采用离心柱法从受检者外周血中分离获得基因组DNA，测定提取DNA的浓度和纯度，并置于-20℃保存。再通过人类红细胞RHD分型试剂盒[聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction sequence specifie primmer, PCRSSP法）]，按照试剂盒说明书进行实验操作，得到的电泳结果与试剂盒的结果分型表比对，判定基因分型结果。RHD外显子1～10测序工作由天津市秀鹏生物科技技术开发有限公司协助完成。

1.4 统计学分析 Rh血型表型频率和单倍型频率等计数资料采用百分比(%)表示，通过SPSS 26.0软件对相关数据进行Pearsonχ2检验或Fisher精确检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RhD阴性确认和基因分型结果 与抗D单克隆抗体凝集强度见表1。对我院24 286例门诊和住院患者血液样本进行检测，凝胶卡法初步筛查出102例阴性样本，初检阴性比例为0.42%。对102例样本进行IAT确认试验、吸收放散试验和PCR-SSP基因分型检测。IAT确认试验检出弱D或部分D共7例（6.86%）。再对其余阴性样本进行吸收放散试验，共检出Del型25例。对所有初检阴性样本进行基因分型试验，结果显示：RHD全缺失型58例（56.86 %），RHD1227A型31例（30.39%），RHD-CE(2-9)-D型7例（6.86%），RHDⅥ typeⅢ型2例（1.96%），RHD1227A/D型1例（0.98%）和3例（2.94%）国内外鲜有报道的等位基因，它们分别为RHDEXON4:491 A＞T，RHD*01N.47，RHD*01N.67。在PCR-SSP确认Del型中，有3例为吸收放散试验中漏检样本。Del型变异占27.45%（28/102），其等位基因均是RHD1227A型，暂未见其他等位基因。RHD（1～10）外显子测序发现了弱D型基因测序部分结果见图1。

表1 弱D或部分D与抗-D试剂凝集强度表（IAT法）

图1 弱D RHDEXON4:491A＞T测序结果

2.2 RhD变异体及RhCcEe表型分布 见表2。对102例初检RhD阴性样本进行RhCcEe表型鉴定，结果显示ccee和Ccee表型占比分别为46.08%（47/102）和36.27 %（37/102），其余表型占比分别为CCee 12.75%（13/102），ccEe 2.94%（3/102）和CcEe 1.96%（2/102）。对所有样本的RhCcEe表型观察频率与理论频率进行卡方检验，差异无统计学意义（χ2=2.625，P=0.676）。提示本研究所纳入的所有初检RhD阴性血液样本的RhCE表型分布符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡。统计方法主要参照文献[2]。表2可见67例RhD非变异体样本中，RhCcEe表型仍主要以ccee和Ccee为主，占比分别为70.15%（47/67）和19.40%（13/67），35例RhD变异体中CCee，CCee占比分别为68.57%（24/35）和28.57%（10/35）。Del型变异体中，仅见Ccee和CCee，未见其他表型。经Fisher检验分析得RhCcEe表型分布频数在RhD变异体与RhD阴性样本间差异有统计学意义（P＜0.05 ）。

表2 RHD初检阴性血清学分类和RhCcEe分型交叉表[n(%)]

3.讨论

RH基因位于人类第1号染色体短臂,包括RHD和RHCE两个紧密连锁排列的基因，它们分别编码D抗原以及C，c，E和e抗原。RHD基因和RHCE基因高度同源（93.8%），均有10个外显子和9个内含子，且均编码417个氨基酸，即D抗原和CcEe抗原。由于其独特的基因构造容易发生杂交，从而导致RHD基因丢失，称为RhD阴性单倍体；或者产生基因变异，形成一系列影响D抗原表达的RhD血清学亚型，即D变异体。临床上常规用抗-D抗体（IgM）对Rh血型进行初步筛查，通常将阴性结果视为Rh阴性血型。但这些初检阴性样本中低频存在有一系列D变异体，它们并不是真正意义上的D抗原完全阴性，红细胞上D抗原的表达有量或质的改变。随后通过IAT和吸收放散法可鉴定弱D、部分D和Del表型。由于血清学试验步骤多，过程繁琐，且结果判定受人为因素较大，因此常会出现误检漏检等情况。如果对D变异体表型鉴定不清，极有可能导致抗-D同种免疫反应的发生。RhD阴性新生儿、孕妇或其他患者输用RhD变异型血液时面临RhD同种免疫的潜在危险[3]；或者，初检使用高效价的单克隆抗体，会出现一些部分D型样本呈现阳性反应，被误判为RhD阳性的情况。由于红细胞表面缺乏一个或数个D抗原表位，当患者妊娠RhD阳性胎儿或输RhD阳性血时，会针对自身缺乏的这部分表位产生抗-D抗体，造成溶血性输血反应、新生儿溶血病等严重的临床免疫反应。

近年来随着对RH基因结构和Rh抗原分子特征的研究，尤其分子遗传背景逐渐明了，基于分子生物学基因分型技术在Rh血型鉴定中得到越来越广泛的应用[4]。以往文献报告显示：相较于高加索人和黑人，亚洲人群中RHD基因的遗传背景更为复杂，其中RHD变异频率远高于其他人种。

部分D形成的分子机制主要为错义突变和RHD-CE-D融合等位基因形成，即RHD基因中的一部分基因被RHCE基因替换形成融合基因而产生。由于RHD和RHCE基因紧密连锁，高度同源性且方向相反，易形成发卡结构从而发生交换重组，并且在遗传学上该融合基因可以稳定遗传[10]。本研究确认的2例部分D样本均为DⅥ typeⅢ，占D抗原弱表现的28.57%，占初检阴性样本的1.96%，此结果与先前文献报道的结果相近[5]。

目前GenBank记录和文献报道的弱D变异种类已近百种。中国人群中主要以弱D15型和弱D12型为主，其中弱D15型约占80%以上[6]。本次研究发现中山地区弱D变异体的基因型表现多样，5例弱D样本中，存在3例等位基因为RHD1227A纯合型，1例为RHD1227A/D 杂合型，1例经进一步RHD（1～10）外显子测序确认为第4外显子的第491号碱基上发生了由A突变成T的纯合突变，记为RHDEXON4:491A＞T。弱D样本中均未见弱D15型和弱D12型，可能与本次研究中收集的D变异体样本量过少有关。

虽然Rh-Del表型具有完整的RHD基因，但红细胞上D抗原的表达极弱，通常需进行吸收放散实验鉴定Del型，但因其步骤繁琐，结果判读受主观因素影响较大，不适合大规模的临床应用。所以一直以来，变异在临床上长期被视为RhD阴性个体，未被正确认识。但近年来，随着国内外文献报道有Rh阴性患者输注Del型血液产生抗-D抗体的病例[7]，Rh-Del变异体也逐渐被重视。与高加索人相比，Del型变异在亚洲RhD阴性人群中占比较高，先前研究报道的数据分别为：沈阳（31.3%）[8]，武汉（24.2%）[9]，合肥（27.2%）[10]，韩国（17.9%）[11]，泰国（20%）[12]。Del型中携带的RHD1227A等位基因为亚洲人种特有，所以常被称“亚洲型”。本次研究结果显示，Del型占初检Rh阴性样本的27.45%（28/102），其中25例样本由吸收放散试验鉴定出，后续采用PCR-SSP基因分型法防止了另外3例Del样品被漏检。这一结果与中国和亚洲其他地区文献中数据相似。本次所检测的28例Del变异体均为RHD1227A纯合子，RHD1227A等位基因在中山地区RhD阴性人群中占比31.37%（32/102），其中1例为RHD1227A/D杂合子，略高于先前针对亚洲人群的文献报告。

对RhCcEe表型检测结果显示，本次纳入的Rh血型样本表型分布符合群体实际分布和 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律。67例RhD阴性样本中，CcEe表型以ccee和Ccee的频率最高，其分布情况与先前报道的四川地区汉族人群分布相似[4]，提示RHD阴性与ce单倍体密切相关，其背后的机制有待进一步探究。RhD变异体与RhC+表型高度相关，28例Del型中Ccee占比最多（75.0%），其次是CCee（25.0%），未检测出其他表型。先前的文献中也可见类似分布，例如：126例来自台湾的Del型血液样本中，Ccee占比84.9%（107/126）,CCee占比15.1%（19/126）[13]，泰国50例Del型样本中，Ccee占比84.0%（42/50），CCee占比16.0%（8/50）[10]。经研究，Del变异型与RhC+表型之间的这种关联可以用C的抑制作用来解释，其中C抗原的表达可以抑制D抗原的表达密度[14]。

综上，中山地区人群中RhD变异体具有极其丰富的多态性和复杂性，存在一系列RhD变异体。仅靠血清学检测难以准确区分RhD变异和RhD阴性个体，或确定D变异的基因型。目前，血清学联合分子生物学方法，有利于提高血型检测结果准确度和规范检测标准化。因此，对本研究中鉴定的各型RhD变异体将会进行特殊管理，建立更加细化的输血规则，旨在节约RhD 阴性血液资源的同时，最大限度保障输血安全及疗效，避免严重并发症的发生。