闫 峰田 悦黄语悠钟丽媛罗玉敏∗

(1.首都医科大学宣武医院脑血管病研究室,北京 100052;2.广州中医药大学科技创新中心,广州 510405)

缺血性脑血管病已成为威胁我国人民健康的头号杀手,随着人口老龄化社会的进入,我国脑血管病的发病率在近几年快速增长[1]。 其中慢性脑缺血作为一种常见的病理状态,伴发于血管性痴呆、老年性痴呆等多种神经系统疾病的进程中。 因慢性脑缺血导致的运动、认知、行为能力以及学习记忆等功能障碍的患者人群越来越多,给患者和家人带来了严重的危害,给社会造成了严重的负担。与急性脑缺血相比,慢性脑缺血的治疗时间窗更长,早期干预,可以改善临床预后。 但目前治疗慢性脑缺血的药物较少,亟待开发。

慢性脑缺血发病机制复杂,最新研究表明,血脑屏障(blood brain barriar, BBB)损伤,参与了慢性脑缺血的发生发展[2-3]。 豨莶通栓(xi-xian-tongshuan,XXTS)胶囊由豨莶草等13 味君臣佐使的中药药物组方,能够活血祛瘀、祛风化痰、舒筋通络、醒脑开窍。 用于缺血性中风风痰痹阻脉络证引起的半身不遂、偏身麻木、口舌歪斜,语言蹇涩。 在慢性脑缺血的治疗中是否能发挥神经保护作用报道较少。 因此,本研究应用慢性脑缺血大鼠模型研究豨莶通栓胶囊对大鼠慢性脑缺血的作用及对BBB的影响,为后续药物的适应症开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠(270~300 g,8~10 周龄)21 只,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司[SCXK(京)2019-0010],饲养于中国疾病预防控制中心SPF 级动物实验室[SCXK(京)2019-0050]。 所有动物实验均遵守3R 原则及首都医科大学宣武医院动物伦理委员会相关要求(xw20211117-1)。

1.2 主要试剂与仪器

豨莶通栓胶囊(山西晋新双鹤药业有限责任公司,国药准字z20040065);异氟烷(河北一品制药股份有限公司,国药准字H19980141);IgG 荧光抗体(Alexa Flour 488,Life,1 ∶500);一抗(occludin,1 ∶250,Abcam,ab31721;claudin-5,1 ∶500, Santa,sc-28670);二抗(1 ∶2000,中杉金桥);基质金属蛋白酶ELISA 试剂盒(MMP-9,江苏酶免实业有限公司,MM-20918R2); 紧密连接蛋白 ELISA 试剂盒(occludin,江苏酶免实业有限公司MM-70051R2;claudin-5,江苏酶免实业有限公司,MM-61504R2)。显微镜(Nikon,941176);水迷宫(上海科欣电子科技有限公司);酶标仪(Labsystems Multiskan MS,芬兰)。

1.3 实验方法

1.3.1 Sprague-Dawley(SD)大鼠CCH 模型及分组

术前12 h 禁食水。 CCH 模型组制作:5%异氟烷吸入诱导麻醉后取仰卧位固定,2%异氟烷维持麻醉状态。 颈部备皮后碘伏消毒,沿颈部正中线切开皮肤,钝性分离筋膜、肌肉组织,充分暴露颈总动脉并小心分离,注意避免损伤迷走神经,用6-0 线结扎右侧颈总动脉,缝合伤口。 30 min 后同样步骤结扎左侧颈总动脉。 假手术组找到双侧颈总动脉并与周围肌肉组织分离而不结扎。 SD 大鼠随机分组:假手术组(Sham,n=7)、模型组(CCH,n=7)、模型+豨莶通栓胶囊组(CCH+XXTS,n=7)。

1.3.2 给药方法

大鼠术后第2 天开始灌胃给药,豨莶通栓胶囊组大鼠给药剂量为500 mg/(kg·d),假手术组与模型组给予相同体积的蒸馏水,所有大鼠术后持续灌胃42 d。

1.3.3 Morris 水迷宫实验

采取Morris 水迷宫方法对大鼠的认知、记忆功能进行评价。 Morris 水迷宫是用来评价大鼠脑缺血后空间学习记忆特征。 本研究在大鼠手术后第37~42 天进行学习训练,第42 天进行记忆检测并记录(具体流程见图1)。

图1 实验流程Figure 1 Experimental sequence

1.3.4 取材与组织标本留存

所有组织与血液均在第42 天完成水迷宫实验后当天取得。 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后下腔静脉采集静脉血液4 mL,EDTA 抗凝。 离心(3000 r/min,10 min)后,取上清血浆并分装,-80℃冷藏待后续检测。 大鼠心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛后取脑组织进行石蜡包埋及切片。

1.3.5 尼氏染色

石蜡切片常规脱蜡后放入1%焦油紫染液中于37℃烤箱中染色30 min,后用蒸馏水小心冲洗脑组织表面染液。 将切片放于95%乙醇溶液中分色后放入新的95%乙醇溶液中脱水2 min。 将切片放入二甲苯溶液中浸泡10 min 后用中性树脂封片。 显微镜下观察海马组织神经元变化并选取代表性位置拍照。

1.3.6 IgG 法检测血脑屏障通透性

大鼠脑组织石蜡切片常规脱蜡后,使用5%BSA+驴血清封闭4℃过夜。 第2 天使用1 ∶200 大鼠IgG 荧光抗体避光孵育24 h。 后使用PBS 常规清洗并用含DAPI 的树脂封片剂封片。 荧光显微镜观察并拍照。

1.3.7 ELISA 检测血脑屏障相关因子

根据ELISA 说明书操作步骤,检测血浆中基质金属蛋白酶和紧密连接蛋白的含量。

1.3.8 Western blot 检测血脑屏障相关蛋白表达

取大鼠海马组织放入裂解液中用超声破碎匀浆后取上清,分光光度计测量蛋白浓度并定量变性后,取20 μg 蛋白上样电泳、电转。 将PVDF 膜用5%牛奶封闭1 h 后,加入一抗,4℃冰箱孵育过夜。次日常规洗膜后二抗室温孵育1 h,常规洗膜后加发光液曝光。

1.4 统计学方法

采用GaphPad Prism8 对实验数据进行统计学分析。 实验数据采用平均数±标准误差(ˉ±sˉx)表示。 实验数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)统计,利用Tukey 进行检验分析。P<0.05代表组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 豨莶通栓胶囊改善慢性脑缺血大鼠学习记忆能力

由于慢性脑缺血常导致认知功能损伤,因此我们使用Morris 水迷宫对不同处理组大鼠的学习记忆能力进行了检测。结果显示,各组大鼠在5 d 的训练中找到平台的潜伏期均随学习次数的增加而下降。 训练第4 天及第5 天后,Sham 组和CCH+XXTS组找到平台的潜伏期均显著低于CCH 组(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.001, 图2A)。 以上结果表明给予豨莶通栓胶囊治疗可以明显改善大鼠慢性脑缺血后学习能力下降的现象。 在撤平台后对大鼠记忆能力的检测中发现,CCH 组大鼠的穿越平台次数、目标象限距离、目标象限时间,较Sham 组均出现明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.001,图2B)。 给予豨莶通栓治疗后,大鼠记忆力改善,CCH+XXTS 组大鼠在目标象限停留时间显著高于CCH 组。 (P<0.01, 图2B)。

2.2 豨莶通栓胶囊改善慢性脑缺血大鼠海马区神经元损伤

尼氏染色结果显示,正常对照组大鼠海马CA1、CA3 区神经元染色可见深蓝色尼氏小体,神经元数目较多;慢性脑缺血后大鼠海马区神经元尼氏小体染色变淡,排列散乱,数量明显减少,胞体缩小。 给予豨莶通栓胶囊治疗后,大鼠海马区神经元,尼氏小体染色较CCH 组明显加深,数量增多,海马CA1、CA3 区神经元损伤得到改善(P<0.05,P<0.01,P<0.01,图3)。

2.3 豨莶通栓胶囊减少慢性脑缺血后大鼠脑组织IgG 渗出

IgG 分子量较大,在正常情况下其只存在于血管中。 当血脑屏障被破坏后,血管中的IgG 会渗漏到脑组织中。 为了观察豨莶通栓胶囊对慢性脑缺血大鼠BBB 通透性的影响,我们对脑组织切片IgG 渗漏情况进行了检测。结果显示,与对照组相比,慢性脑缺血损伤大鼠脑组织IgG 漏出量明显增多,给予豨莶通栓胶囊治疗后,可以显著减少大鼠脑组织中IgG 的漏出量(P<0. 05,P<0. 01,图4)。

注:与Sham 组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001;与CCH 组相比,##P<0.01。图2 豨莶通栓胶囊改善慢性脑缺血大鼠学习记忆能力(n=7)Note. Compared with Sham group, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01, ∗∗∗P<0.001. Compared with CCH group, ##P<0.01.Figure 2 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the learning and memory abilities of CCH rats

注:与Sham 组相比,∗∗P<0.01;与CCH 组相比,#P<0.05,##P<0.01。图3 豨莶通栓胶囊改善慢性脑缺血大鼠海马区神经元损伤(n=3)Note. Compared with Sham group, ∗∗P<0.01. Compared with CCH group,#P<0.05, ##P<0.01.Figure 3 Xi-xian-tong-shuan capsules reduce the number of Nissl body in hippocampus

2.4 豨莶通栓胶囊减少慢性脑低灌注大鼠血浆MMP-9、occludin、claudin-5 浓度

我们应用ELISA 的方法检测了Sham 组、CCH 组、CCH+XXTS 组血浆中MMP-9、occludin、claudin-5 的蛋白浓度。结果显示与假手术相比,CCH 组血浆中MMP-9、occludin、claudin-5 浓度显著高于Sham 组,给予豨莶通栓胶囊可显著降低慢性脑缺血损伤后血浆中MMP-9、occludin、claudin-5 浓度(P<0. 01,P<0. 001,P<0. 0001,P<0. 0001,图5)。

2.5 豨莶通栓胶囊增加慢性脑低灌注大鼠脑组织中紧密连接相关蛋白表达的影响

我们应用Western blot 的方法检测了Sham 组、CCH 组、CCH+XXTS 组脑组织中紧密连接相关蛋白occludin 和claudin-5 的表达情况。结果显示与Sham 组相比,CCH 组中occludin 和claudin-5 的表达显著减少,给予豨莶通栓胶囊治疗可显著上调上述紧密连接蛋白的表达(P<0.05,P<0.05,图6)。

注:与Sham 组相比,∗∗∗P<0.0001,∗∗∗∗P<0.0001;与CCH 组相比,##P<0.01,####P<0.0001。图5 豨莶通栓胶囊减少慢性脑缺血大鼠血浆MMP-9、occludin、claudin-5 水平(n=7)Note. Compared with Sham group, ∗∗∗P<0.0001, ∗∗∗∗P<0.0001. Compared with CCH group, ##P<0.01, ####P<0.0001.Figure 5 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the leave of MMP-9, occluding and claudin-5 in plasma

注:与Sham 组相比,∗P<0.05;与CCH 组相比,#P<0.05。图6 豨莶通栓胶囊改善慢性脑缺血大鼠脑组织中occludin、claudin-5 水平(n=3)Note. Compared with Sham group, ∗P<0.05. Compared with CCH group, #P<0.05.Figure 6 Xi-xian-tong-shuan capsules improve the leave of occludin and claudin-5 in brain

3 讨论

慢性脑血管病与动脉粥样硬化、糖尿病、肾病等常见病息息相关,目前的研究发现慢性脑血管病的损伤机制主要包括脑白质损伤、神经炎症、细胞新生、神经细胞凋亡坏死等,血脑屏障作为中枢神经系统与外周的屏障,其在慢性脑血管病中的作用越来越受到重视[4-6]。 长期脑血管低灌注会导致BBB 受损,通透性增加,脑微血管中水分和血浆蛋白的渗出,进而造成细胞间隙水分的增加,形成血管源性水肿。 我们应用大鼠双侧颈总动脉结扎慢性脑缺血模型,观察脑慢性缺血后给予豨莶通栓胶囊42 d 后,观察大鼠学习记忆能力和血脑屏障等情况。 我们发现豨莶通栓胶囊可以明显改善慢性脑缺血造成的大鼠学习记忆能力下降的现象。 在水迷宫实验中我们发现,给予豨莶通栓胶囊治疗组大鼠在撤平台后其穿台次数及目标象限时间均较模型组有明显改善。 说明了豨莶通栓胶囊对于改善慢性脑缺血后认知记忆功能下降方面的作用。 虽然在目标象限距离指标中豨莶通栓治疗组与模型组没有统计学差异,但由于目标象限时间和游速决定的,部分豨莶通栓治疗组组动物在到达其记忆的平台位置漂浮在水中不再移动,因而产生了此种结果。 在血脑屏障功能检测中我们发现慢性脑低灌注损伤后大鼠血脑屏障破坏,而豨莶通栓胶囊治疗后可显著改善此情况。 我们通过实验证实脑组织BBB 破坏后引起毛细血管的通透性增加,可以使正常情况下只存在于血管中的大分子IgG 通过破坏的BBB 进入脑组织,因此测定脑组织中IgG 渗出量可以反映BBB 开放程度[7]。 我们通过对大鼠脑组织中IgG 的荧光染色发现,豨莶通栓胶囊治疗可以显著减少慢性脑低灌注损伤后可脑组织中IgG 的含量。 以上结果提示我们,豨莶通栓胶囊治疗可以改善慢性脑低灌注损伤后BBB 的损伤、降低其通透性。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是含有Zn2+的蛋白水解酶家族。 一方面,MMPs 可以降解细胞外基质(ECM),进而使得脑毛细血管的通透性增加,引起水分和血浆蛋白的渗出,形成水肿。 另一方面,MMPs 对基底膜和内皮细胞间的紧密连接的破坏直接导致BBB 损伤,参与多种病理情况下的BBB 的开放[8-11]。 紧密连接相关蛋白在维持BBB 完整性的过程中发挥关键的作用,其结构和功能的破坏将引起BBB 通透性增加,甚至脑水肿。 其中claudin-5 和occludin 蛋白是细胞与细胞之间紧密连接完整性最关键的成分[12-13]。 研究发现,缺血损伤可以上调脑组织中MMP-9 的表达,与缺血损伤后脑水肿和BBB 开放密切相关,其机制可能与MMP-9 直接降解紧密连接蛋白有关[14]。 因此为了进一步证实豨莶通栓胶囊对慢性脑低灌注损伤后BBB 的保护作用,我们对血液中的MMP-9以及血液和脑组织中的紧密连接相关蛋白的表达进行了测定。 我们发现血液中的claudin-5 和occludin 含量明显升高,这与临床研究发现脑血管病人血清中其二者的变化结果相一致[15],且MMP-9的表达量明显上调。 在脑组织中的紧密连接相关蛋白表达检测中我们发现紧密连接相关蛋白表达明显减少。 并且豨莶通栓治疗后能够明显改善以上结果。 这些研究结果均提示,豨莶通栓胶囊可能通过抑制MMP-9 的表达,减少脑组织中紧密连接相关蛋白claudin-5 和occludin 的降解,最终发挥对BBB 的保护作用。

综上所述,豨莶通栓胶囊可能通过保护血脑屏障的功能发挥神经保护作用,改善慢性脑缺血后大鼠的认知功能。